硫化铜微粒在消化道肿瘤光热治疗中的应用研究

摘要

目的：
　　消化道肿瘤呈全球高发趋势，威胁人类的健康，造成巨大的社会医疗经济负担。目前，早诊早治是防治消化道肿瘤的有效方式，结合快速发展纳米探针与分子影像技术实现肿瘤诊疗一体化，是提高肿瘤检出率、提高治疗效果的有效方法。近年来，光热治疗（Photothermal therapy, PTT）已成为一种肿瘤诊疗一体化新模式，展现了巨大的转化医学和临床应用潜力。近期研究表明硫化铜具有高效的光热转化效能，同时具有高信噪比的光声成像对比度，是一种可以实现光声成像-光热治疗的诊疗一体化介质。本研究通过离体测定亚微米级硫化铜理化性质、980nm近红外激光照射CuS颗粒光热转化效率评估亚微米级硫化铜光热效应，通过细胞水平和活体动物水平实验分析硫化铜光热治疗效果、生物毒性和安全性，为硫化铜的临床转化应用探寻新的方向与应用模式，为肿瘤诊疗一体化探索新的技术。
　　方法：
　　利用四种不同粒径范围的亚微米级硫化铜粉末进行实验探究。这四种亚微米级CuS粒径范围分别约为80-100nm，100-200nm，200-400nm，300-600nm。实验内容包括亚微米级硫化铜的性质测定、体外细胞实验以及小动物活体实验三个部分。
　　1、电镜观察CuS粒径范围，测定不同粒径CuS光热转换性质，观察浓度梯度以及激光照射时间对光热转换温度的影响；测定CuS微粒光热稳定性，观察多次照射后光热转换效率变化情况。
　　2、显微镜体外观察将CuS亚微米颗粒与结肠癌细胞孵育后对活细胞生长的影响，利用CCK-8法观察四种粒径、不同浓度的CuS溶液对结肠癌细胞的细胞毒性。用980nm近红外激光照射含不同浓度CuS颗粒的细胞培养基10min，观察培养基温度与CuS浓度梯度、照射时间的关系。利用Annexin V-FITC/PI对近红外激光照射前后的细胞凋亡情况进行分析，研究CuS光热效应对的杀伤作用。
　　3、利用GFP-Luc SW480结肠癌细胞株制备裸鼠皮下移植瘤，肿瘤长至7mm左右时进行小动物活体实验，通过小动物活体成像、病理切片等方法观察瘤体注射CuS颗粒后经980nm近红外激光照射对肿瘤组织的杀灭、消融作用。利用ICP-OES观察小鼠胃肠道对亚微米级CuS颗粒的吸收情况，并对小鼠胃肠道进行病理检测观察亚微米级CuS颗粒对小鼠胃肠道的毒性作用。
　　结果：
　　1、980nm近红外激光以0.6W/cm2的功率照射四种不同粒径范围的CuS颗粒溶液，溶液温度随着照射时间增加而增高、随着CuS浓度的增加而增高，但粒径与温度变化没有明显的相关性。
　　2、光热稳定性实验表明反复5次照射后所测CuS溶液升温程度、升温速度一致，说明亚微米CuS颗粒具有良好的光热稳定性。
　　3、结肠癌细胞培养基中置入各样本CuS，并经980nm近红外激光照射10min，测温仪所测得的温度同样也会随着CuS液体浓度的增加而升高，但温度升高到一定程度后不会继续上升。
　　4、CCK-8观察不同浓度CuS溶液对结肠癌细胞生长情况影响时发现，浓度<200ug/ml时，各样本组的细胞活性率均在80％以上；当浓度为400ug/ml时，四种粒径硫化铜对HCT116的生长开始产生影响，80-100nmCuS组，100-200nmCuS组，200-400nmCuS组以及300-600nmCuS组的细胞活性率依次为：70.2±1.3%，61.3±2.3%，57.9±2.01%，56.2±2.3%；当浓度达800ug/ml时，细胞活性下降至40%以下，80-100nmCuS组，100-200nmCuS组，200-400nmCuS组以及300-600nmCuS组的细胞活性率依次为：38.9±8.75%、25.7±2.8%,、26.8±5.6%、56.2±3.9%。
　　5、利用Annexin V-FITC/PI检测近红外激光照射前后细胞凋亡情况发现， CuS+HCT116+激光组与HCT116组、CuS+HCT116组以及HCT116+激光组相比，表现出显著的肿瘤激光热杀伤效应（P<0.05）。
　　6、小动物活体荧光成像显示，瘤体注射CuS颗粒后经980nm激光照射后移植瘤处荧光信号消失，证明对肿瘤有显著的杀灭消融效果，而空白对照组和蒸馏水瘤体注射对照组移植瘤处均可见荧光信号。
　　7、ICP-OES检测Cu2+分布结果显示：粪液、胃组织、小肠组织和结肠组织中Cu2+含量分别占CuS灌胃量的57%、3%、15%和8%，证明亚微米级CuS颗粒通过灌胃方式进入胃肠道，大部分可通过粪便形式排泄出来。胃肠道组织病理检测证明未见明显的急性炎症毒性反应。
　　结论：
　　1、 CuS微粒具有良好的光热转化效率、光热稳定性，具有良好的光热治疗应用价值；
　　2、经980nm近红外激光照射不同粒径、不同浓度硫化铜溶液后，其温度的变化与浓度和时间有关、与微粒粒径无关，升温均可达到42℃以上且温度升高速度平稳、变化幅度小，证明具有安全可靠的临床应用潜力。
　　3、低浓度硫化铜微粒无显著细胞毒性，经近红外照射后产生光热效应可以显著杀灭肿瘤细胞，小动物活体实验证实对肿瘤组织有良好的消融效果，证明CuS具有很好的光热治疗效果。
　　4、亚微米级硫化铜胃肠道局部应用后大部分经粪便排出，胃肠道对亚微米级硫化铜颗粒具有很少的吸收作用且病理证实无显著毒性，说明亚微米级硫化铜颗粒消化道管腔局部喷洒应用这一给药途径具有较高的安全性。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

1材料与方法

1.1实验材料及仪器

1.1.1 实验材料

1.1.2 实验仪器

1.2 实验方法

1.2.1 CuS微粒性质测定

1.2.2 细胞培养

1.2.3 体外细胞实验

1.2.4 动物实验

1.2.5 活体动物胃肠道对亚微米级CuS颗粒的吸收分析

1.2.6 数据处理及统计分析

2结 果

2.1 CuS微粒性质测定

2.1.1高分辨率透射电镜观察（TEM）

2.1.2微粒光热转换性质测定

2.1.3微粒的光热稳定性分析

2.2体外细胞实验

2.2.1 CuS对HCT116细胞的影响

2.2.2结肠癌细胞中的CuS光热转换性质测定

2.2.3利用Annexin V-FITC/PI检测近红外激光照射前后细胞凋亡情况

2.3小动物活体成像及肿瘤病理观察

2.4亚微米级CuS颗粒在小鼠胃肠道中的吸收情况

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述：纳米药物在胃肠道中的应用

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