八肋游仆虫大核人工染色体的构建及L11、eRF1a、eRF3的细胞定位

摘要

原生动物（Protozoa）是一类完整的、可营独立生活的单细胞有机体;是最原始、最简单、最低等的单细胞真核生物。细胞内有各种特化的细胞器，具有维持生命和延续后代所需的一切功能。原生动物的密码子使用特殊性、多核现象、大核中基因大小的染色体结构等特征，使其成为分子细胞生物学研究的理想材料和模式生物。目前，纤毛虫作为模式生物在细胞生物学、分子生物学等相关研究中逐渐深入。纤毛虫纲（Ciliata）是原生动物中种类最多、结构最复杂的一个纲。纤毛虫具有两种类型细胞核，即大核与小核。大核具有转录活性，与细胞的RNA合成有关，也称营养核(vegetative nucleus);小核无转录活性，与细胞的DNA合成有关，也称生殖核(reproduction nucleus)。无性生殖行横分裂，有性生殖为接合生殖(conjugation)。八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)是纤毛虫纲游仆科(Euplotidae)的一个具有代表性的种。细胞内只含有一个大核，一个小核。大核中染色体被称为基因大小的染色体，其特殊的结构是:两端是端粒和上下游调控序列（非编码区）、中间是基因的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)。鉴于其特殊的细胞核结构、特殊的进化地位及密码子使用特异性等特点，我们将其作为研究对象。
　　人工染色体(artificial chromosome)是采用分子克隆技术人工组建的具有染色体功能的DNA分子。DNA复制起点、着丝粒、端粒是确保染色体复制及稳定遗传的三种必备功能元件。例如酵母人工染色体(YAC)和细菌的人工染色体(BAC)的成功构建极大推动了生物基因组学的研究。绿色荧光蛋白基因(Green Fluorescent Protein，GFP)是近年来被广泛使用的新型报告基因，GFP可自发荧光，具有荧光检测方便且稳定、无毒害、通用性、分子量小易于构建载体、可实时动态观察、易于得到突变体等优点，被广泛应用于目的基因表达与蛋白定位、及共定位的功能组学研究中。
　　首先，为研究八肋游仆虫中与蛋白质合成相关基因的功能，本文成功构建了八肋游仆虫含绿色荧光蛋白基因的大核人工染色体(Macronuclear ArtificialChromosome of E.octocarinatus Harboring Codon-optimized EGFP Gene, EoMAC_G),建立了八肋游仆虫活细胞内蛋白表达与定位体系;进一步在八肋游仆虫中进行了绿色荧光蛋白基因的表达，并通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）的方法成功干扰了密码子优化后的GFP基因(Enhanced Green Fluorescent Protein inEuplotes octocarinatus，EGFP-Eo)的表达，证实了纤毛虫中RNA干扰的可行性。通过脂质体转染方法将携带有EoMAC_G的pBTub-Tel载体转染进入八肋游仆虫大核，分析了EGFP-Eo基因在八肋游仆虫细胞中的表达。荧光显微镜观察发现EGFP-Eo产生的荧光均匀分布于八肋游仆虫细胞质中。在细胞进行有丝分裂的情况下荧光可持续20 d以上。相比pEGFP-N1质粒转化的游仆虫，人工染色体中的EGFP-Eo基因表达的荧光亮度强、稳定且持续时间长。Western blotting分析进一步证实了外源EGFP-Eo基因在细胞中过量表达。通过细菌喂食法进行纤毛虫RNA干扰实验，抑制了外源EGFP-Eo基因在八肋游仆虫细胞中的表达。
　　利用构建的人工染色体不仅便于外源基因在八肋游仆虫细胞内的表达，对目的蛋白质进行活细胞实时动态定位分析;还可通过RNAi的方法调控外源基因在纤毛虫细胞中的表达，便于目的基因功能的进一步分析。
　　其次，为检测八肋游仆虫人工染色体的功能，我们将八肋游仆虫中心蛋白基因克隆进入八肋游仆虫大核人工染色体中，对其进行了活细胞定位分析，进一步探讨了其功能;研究发现中心蛋白分布于发育过程中的八肋游仆虫棘毛的基体，其可能参与了新生基体中微管的复制及组装，进而参与八肋游仆虫棘毛的形成。为进行两种目的蛋白质的细胞共定位研究，我们构建了八肋游仆虫含红色荧光蛋白基因(Red Fluorescent Protein，RFP)的大核人工染色体EoMAC_R:即将β2微管蛋白基因的上下游调控序列和端粒序列分别克隆至pDsRed1-N1质粒中的多克隆位点和红色荧光蛋白基因的上下两端。将第一类肽链释放因子基因（eRF1a）和L11基因分别克隆进入EoMAC_G和EoMAC_R两个大核人工染色体中，在八肋游仆虫细胞中进行eRF1a与L11的共定位分析。激光共聚焦显微镜观察发现二者在细胞中大核附近的细胞质中分布，且有共定位位点，二者共同参与八肋游仆虫细胞内蛋白质的合成与终止的重要过程。eRF1a和eRF3是八肋游仆虫中参与蛋白质合成终止的两类两类肽链释放因子，对二者在高等真核生物中的功能和相互作用关系已多有研究，但仍无细胞定位方面的研究报道。通过对二者的细胞定位分析显示，在八肋游仆虫细胞大核的内侧有共定位位点，说明二者共同参与了细胞内重要的生物学过程，即蛋白质合成终止的新生肽链的释放。鉴于eRF3的多功能性，进一步的分子细胞生物学研究有待深入进行。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 研究对象及意义

1．1 八肋游仆虫特殊的进化地位

1．2 八肋游仆虫核结构的特殊性

1．3 八肋游仆虫密码子使用的特殊性

2 研究方法

2．1 构建人工染色体

2．2 报道基因——绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白基因

2．3 脂质体转染法

3 研究内容、目的及意义

3．1 研究内容及目的

3．2 研究意义

参考文献

第二章 八肋游仆虫含绿色荧光蛋白基因的大核人工染色体的构建及功能分析

1 前言

2 材料

2．1 菌株及质粒

2．2 主要酶及试剂

2．3 溶液配制

2．4 实验所用引物

2．5 主要实验仪器

3 方法

3．1 八肋游仆虫大核人工染色体EoMAC_G的构建

3．2 绿色荧光蛋白基因在八肋游仆虫中的表达

3．3 Western blotting实验分析EGFP-Eo基因在八肋游仆虫中的表达

3．4 八肋游仆虫细胞EGFP-Eo基因表达的RNA干扰

4 结果

4．1 八肋游仆虫大核人工染色体(EoMAC_G)的构建

4．2 绿色荧光蛋白基因在八肋游仆虫活细胞中的表达

4．3 Western blotting实验分析EGFP-Eo基因在八肋游仆虫中的表达

4．4 八肋游仆虫细胞EGFP-Eo基因表达的RNA干扰分析

5 讨论

参考文献

第三章 八肋游仆虫中心蛋白的细胞定位

1 前言

2 材料

2．1 材料

2．2 主要酶及试剂

2．3 溶液配制

2．4 试验所用引物

2．5 主要实验仪器

3 方法

3．1 八肋游仆虫中心蛋白基因的系统学分析

3．2 pBTub-Tel-EoCen融合蛋白载体的构建

3．3 八肋游仆虫中心蛋白的细胞定位

4 结果

4．1 八肋游仆虫中心蛋白的系统学分析

4．2 pBTub-Tel-EoCen融合蛋白载体的构建

4．3 八肋游仆虫中心蛋白的细胞定位

5 讨论

参考文献

第四章 肽链释放因子eRF1a与L11在八肋游仆虫细胞中的共定位

1 前言

2 实验材料

2．1 材料

2．2 试验所用引物

2．3 主要实验仪器

3 方法

3．1 八肋游仆虫含红色荧光蛋白人工大核染色体的构建

3．2 重组质粒pDsRed1-N1-Tel-L11的构建

3．3 重组质粒pBTub-Tel-eRF1a的构建

3．4 肽链释放因子eRF1a与L11在八肋游仆虫中的共定位

4 结果

4．1 八肋游仆虫含红色荧光蛋白人工大核染色体的构建

4．2 重组质粒pDsRed1-N1-Tel-L11的构建

4．3 重组质粒pBTub-Tel-eRF1a的构建

4．4 肽链释放因子eRF1a与L11蛋白在八肋游仆虫中的共定位

5 讨论

参考文献

第五章 肽链释放因子eRF1a与eRF3在八肋游仆虫中的共定位

1 前言

2 材料与仪器

3 方法

3．1 重组质粒pDsRed1-N1-Tel-eRF1a的构建

3．2 重组质粒pBTub-Tel-eRF3的构建

3．3 两类肽链释放因子eRF1a与eRF3在八肋游仆虫中的共定位

4 结果

4．1 重组质粒pDsRed1-N1-Tel-eRF1a的构建

4．2 重组质粒pBTub-Tel-eRF3的构建

4．3 两类肽链释放因子eRF1a与eRF3在八肋游仆虫中的共定位

5 讨论

参考文献

总结与展望

附录Ⅰ

附录Ⅱ 个人简介及所发表文章

致谢

声明