利用基因工程菌HC01固定化细胞制备D-对羟基苯苷氨酸

摘要

D-型氨基酸在生物界广泛存在并且具有天然氨基酸所不具备的优良性能，在药物合成、饲料、食品等方面有广泛的用途。在D-氨基酸的生产中，海因酶法即利用D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶两种酶连续催化5'-单替代海因从而生成相应的D-氨基酸的方法，由于其低消耗，高产率、高反应速率及温和的反应条件而成为工业生产的首选方法。人们构建不同的基因工程菌以期找到适合工业化生产的菌种，本室已经构建了一株可以同时表达海因酶和水解酶的基因工程菌HC01，前期的工作为下一步实验提供了研究基础。
　　对一菌两酶工程菌HC01转化底物DL-对羟基苯海因(DL-HPH)的最适条件及其细胞固定化进行了研究，HC01游离细胞转化DL-HPH的最适条件为40℃，pH7.5。通过对固定化细胞酶活力测定，确定细胞固定化的最优条件为海藻酸钠浓度2.5％，细胞浓度为0.029 g/mL，钙离子浓度为3％。固定化HC01的热稳定性比游离细胞高5℃，二价金属离子Mn2+、Mg2+、Cu2+、Co2+和Ni2+在浓度为0.1 mmol/L时对固定化细胞中D-海因酶(HYD)和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(CAB)两酶的活力无显著影响，Mn2+和Mg2+可分别使游离细胞中CAB活力提高至原来的2.1和2.7倍。固定化细胞重复使用六次后仍然保持80％活力，并且使用十次后小球没有破裂，在4℃贮存半衰期可达到12天，显示了良好的稳定性。
　　利用以上固定化细胞以对羟基苯海因为底物生产D-对羟基苯甘氨酸，用相当于1L菌体活力的固定化细胞转化1L30 g/L的底物，在氮气保护下，当初始pH为9.0，转化温度为40℃，转速为80 r/min，36小时后转化率可达97％左右，反应液经离心，上清液旋转蒸发后，用1N HCL酒精重新溶解，过滤后调pH至7.0即可结晶得到D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)，再用95％乙醇洗涤后烘干可得到了光学纯度为99.7％的D-HPG且得率为85％。利用高效液相色谱(HPLC)、核磁共振(NMR)、傅里叶红外光谱(FT-IR)对所制备的产物进行了表征分析，确定其为D-HPG。
　　外源基因在大肠杆菌中由于过度表达而易形成包涵体，利用油体蛋白的特性可以对酶进行一步复性、纯化和固定化。本文将油体蛋白基因融合到海因酶基因的C端，将该融合基因分别克隆到pQE30、pET-3a和pET-28a表达载体中，然后转入大肠杆菌感受态细胞诱导表达，在pET28a-hydole/BL21中得到了大量表达的融合蛋白，SDS-PAGE分析主要以包涵体的形式存在，制作人工油体后未检测到酶活性，可能是制作人工油体的条件不适合海因酶复性，仍需进一步探索人工油体的制备条件。

目录

摘要

第一章 综述

1．1 D-氨基酸

1．1．1 D-氨基酸的特性、分布及用途

1．1．2 D-氨基酸的制备方法

1．2 双酶法一步法生产D-氨基酸

1．2．1 D-海因酶(D-hydantoinase，HYD)

1．2．2 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(CAB)

1．2．3 双酶转化法生产D-氨基酸国内外研究进展

1．3 细胞固定化

1．3．1 载体结合法

1．3．2 交联法

1．3．3 包埋法

1．4 本论文研究的目的和意义

参考文献

第二章 双酶(HYD和CAB)共转化工程菌细胞的固定化及其性质的研究

2．1 前言

2．2 材料

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．2．3 菌种

2．3 方法

2．3．1 工程菌HC01的培养

2．3．2 固定化细胞的制备

2．3．3 酶活性的测定

2．3．4 高效液相分析

2．4 结果与分析

2．4．1 工程菌HC01最适pH的测定

2．4．2 工程菌HC01最适温度的测定

2．4．3 菌体与载体量的优化

2．4．4 固定化细胞与游离细胞的基本生化性质的比较

2．5 讨论

参考文献

第三章 利用固定化细胞生产D-对羟基苯甘氨酸

3．1 前言

3．2 材料

3．2．1 主要仪器

3．2．2 主要试剂

3．2．3 菌种

3．3 方法

3．3．1 工程菌HC01的培养与固定化细胞的制备

3．3．2 利用固定化细胞转化生产D-HPG

3．3．3 比旋光度的测定

3．3．4 高压液相色谱分离条件

3．3．5 红外光谱的测定

3．3．6 核磁条件

3．4 结果

3．4．1 D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)的生物转化

3．4．2 比旋光度测定

3．4．3 高压液相分析

3．4．4 D-对羟基苯甘氨酸的红外图谱及其分析

3．4．5 核磁分析

2．5 讨论

参考文献

第四章 利用油体蛋白一步法纯化和固定海因酶

4．1 前言

4．2 材料

4．2．1 主要仪器

4．2．2 主要试剂

4．2．3 菌种

4．2．4 培养基

4．2．5 寡聚核苷酸

4．3 方法

4．3．1 D-海因酶和油体蛋白(oleosin)融合蛋白表达载体的构建

4．3．2 D-海因酶和油体蛋白(oleosin)融合蛋白表达载体的诱导表达

4．3．3 人工油体蛋白的制作

4．3．4 D-海因酶和油体蛋白(oleosin)融合蛋白的变复性

4．4 结果与分析

4．4．1 重组质粒的构建

4．4．2 D-海因酶和油体蛋白(oleosin)融合蛋白表达

4．4．3 人工油体蛋白的制作及融合蛋白的变复性

4．5 讨论

参考文献

个人简历

已发表的学术论文

致谢

声明