镉致长江华溪蟹鳃细胞调亡的研究

摘要

本论文采用急性毒性实验方法，研究了镉(Cd2+)对长江华溪蟹（Sinopotamonyangtsekiense）鳃组织细胞凋亡的影响。实验设置五个浓度组(7.25、14.50、29.00、58.00和116.00 mg·L-1)和一个对照组，处理时间24、48、72和96 h。首先，利用显微与亚显微技术、吖啶橙和溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色法、原位末端标记法(TUNEL)以及琼脂糖凝胶电泳法，从细胞形态学和生物化学水平检测了鳃组织细胞的凋亡。其次，为了探讨Cd2+诱导细胞凋亡的途径，对不同浓度Cd2+处理鳃组织48 h，半胱天冬酶-3(caspase-3)、半胱天冬酶-8（caspase-8）、半胱天冬酶-9（caspase-9）活力进行了测定。之后，就Cd2+诱导鳃组织细胞凋亡的机制做了进一步研究。以不同浓度Cd2+处理48 h检测乳酸脱氢酶(LDH)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力，以及过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)，超氧阴离子(O2-·)含量。另外，在细胞凋亡执行蛋白caspase-3基因方面也做了初步研究。通过提取鳃组织细胞总RNA，cDNA第一链的合成、特异性引物设计、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳以及产物回收，获得一条核苷酸序列并进行了测序分析。具体结果如下:
　　(1)经Cd2+处理后，显微与亚显微观察检测到了典型的细胞凋亡特征，具体表现为核边集、核膜折叠、核染色质致密浓缩、核裂解形成凋亡小体等现象;琼脂糖凝胶电泳图谱出现凋亡细胞所特有的DNA梯状条带。随着Cd2+浓度的增加和处理时间的延长，凋亡细胞所占比例呈现先升后降的趋势，凋亡指数的变化表现出显著的剂量与时间-效应关系。随着Cd2+浓度的增加，caspase-3、caspase-9、iNOS活力逐渐升高，且酶活力的增高与凋亡指数的上升呈正相关关系;caspase-8活力较对照组无显著性差异，与凋亡指数变化相关度较低。
　　(2)处理48 h，随着Cd2+浓度的增加，凋亡细胞数较对照组比较均出现了不同程度的增加;LDH活力不断上升，但是较对照组差异不显著;O2-的含量先升后降;·OH含量一直处于被抑制状态;H2O2含量没有发生显著变化。
　　(3)实验得到了一条核苷酸序列，经分析其中一部分与凡纳滨对虾Litopenaeusvannamei中caspase-3基因片段相似度极高，另外一部分片段与大肠杆菌Escherichiacoli体内的功能蛋白基因即蛋白复制基因片段相似度极高。处于上下游的两个基因片段有重叠部分，经分析重叠部分有与启动子相似度极高的核苷酸序列，该基因可能参与了蛋白质表达调控机制。
　　结论:
　　(1)镉能够引起长江华溪蟹鳃组织细胞凋亡;细胞凋亡的检测以及凋亡指数的变化能够灵敏反映镉对水生动物的胁迫程度及毒性大小，可作为水生态环境镉污染程度的生物指标。
　　(2) Cd2+处理48 h，长江华溪蟹鳃组织细胞膜发生了轻微损伤，但是没有达到膜内物质泄漏的程度;活性氧中的三个重要组成成员可能不是诱发细胞凋亡的因素，而可能是一氧化氮介导了氧化胁迫引起的细胞凋亡。
　　(3) iNOS激活后生成过量NO，引起线粒体损伤，促使细胞经由caspase-9介导的线粒体凋亡途径发生细胞编程性死亡;而caspase-8介导的死亡受体凋亡途径在该过程中并不占主导地位。
　　(4)可利用cDNA末端快速克隆技术(RACE)扩增出凋亡相关蛋白caspase-3基因全长以及其它功能蛋白基因，进而阐述镉诱导华溪蟹鳃组织细胞凋亡机制以及其它相关蛋白与凋亡的发生之间的关系。

目录

摘要

第一章 综述

1 镉的污染现状和危害

1．1 镉的污染现状

1．2 镉的毒性及其危害

2 镉诱导细胞凋亡的研究进展

2．1 镉诱导动物细胞凋亡

2．2 镉诱导动物细胞凋亡机制

3 本论文研究的目的及意义

Chapter Two Effects of Cadmium on Apoptosis in Gills of Freshwater Crab，Sinopotamon yangtsekiense

1 Material and methods

1．1 Animals and treatments

1．2 Histopathologic examination

1．3 Transmission electron microscopy

1．4 Measurement of apoptotic DNA-fragmentation

1．5 Enzyme activity assay

1．6 Protein concentration assays

1．7 Chemicals

1．8 Statistical analysis

2 Results

2．1 Detection of apoptosis in gills of S．yangtsekiense exposed to cadmium under microscope

2．2 Detection of apoptosis in gills of S．yangtseldense exposed to cadmium by transmission electron microscopy

2．3 The effect of Cd on the DI，NI and AI in gills of S．yangtsekiense

2．4 Detection of apoptosis in gills of S．yangtsekiense exposed to cadmium by agarose gel electrophoresis

2．5 The effect of Cd on the iNOS activity in gills of S．yangtsekiense

2．6 The effect of Cd on the caspase-3，9，8 activity in gills of S．yangtsekiense

3 Discussion

4 Conclusion

第三章 镉诱导长江华溪蟹鳃组织细胞凋亡机制的初步研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验试剂

1．4 数据处理与统计分析

2 结果

2．1 AO／EB法检测镉诱导长江华溪蟹鳃组织细胞凋亡

2．2 TUNEL法检测长江华溪蟹鳃组织细胞凋亡及凋亡指数

2．3 镉对长江华溪蟹鳃组织LDH活力的影响

2．4 镉对长江华溪蟹鳃组织O2-·的影响

2．5 镉对长江华溪蟹鳃组织·OH的影响

2．6 镉对长江华溪蟹鳃组织H2O2的影响

3 讨论

4 结论

第四章 长江华溪蟹鳃组织细胞Caspase-3基因的初步研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验试剂

1．4 数据分析

2 结果

2．1 长江华溪蟹鳃组织细胞RNA的提取

2．2 长江华溪蟹鳃组织细胞PCR初次扩增产物图谱

2．3 长江华溪蟹鳃组织细胞PCR再次扩增产物图谱

2．4 长江华溪蟹鳃组织细胞产物测序及序列分析

3 讨论

4 结论

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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