细带闪蛱蝶线粒体基因组特征及系统发育研究

摘要

作为分子系统学研究的首选，线粒体基因组核苷酸序列在确定动物类群的系统分类地位和系统发生关系等方面起到了积极的作用。线粒体基因组以其结构简单、DNA序列进化保守、普遍为母性遗传和较少发生基因重组等特点，近年来被广泛应用于生物系统学及进化生物学的研究。mtDNA的核苷酸序列、基因组的碱基组成和基因排列方式，为解决六足类动物的系统发生关系提供了有价值的分子证据。蛱蝶科昆虫历来是鳞翅目昆虫系统发育研究的重要类群，在形态学和分子生物学各方面都得到了快速发展。然而相对于蛱蝶科昆虫庞大的类群来说，已有的线粒体基因组数据只占了极少部分，以往的系统发育研究主要是基于形态特征或1-3个基因序列进行分析，所依据的系统发育分子证据有限，另外，由于线粒体基因组结构相对简单，多数基因变异速率较快，对于蛱蝶科高级阶元系统发生关系的探讨存在一定的局限性，并且相对于单个基因的序列对比而言，研究线粒体基因组重排等比较基因组学手段将更适合于较大时间尺度上系统发育关系的探讨。
　　本研究通过Long-PCR及引物步移法，对蛱蝶科昆虫细带闪蛱蝶Apatura metis线粒体基因组进行了全序列的测定、拼接和基因注释及其结构分析，通过联合GenBank已测序的其它3种蛱蝶科昆虫线粒体基因组数据，从线粒体基因组的大小、基因排列顺序、碱基组成、蛋白质编码基因密码子的使用、tRNA基因和rRNA基因以及A+T丰富区等方面对蛱蝶科物种的线粒体基因组进行了详细的比较及分析，并联合鳞翅目的全线粒体基因组数据对系统发育关系进行重建。获得的发现及结论如下:
　　1、细带闪蛱蝶Apatura metis的全线粒体基因组的长度为15，236 bp，包含13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和长度为394bp的A+T富含区。
　　2、蛱蝶科昆虫的线粒体基因组的基因重排速率较低，与节肢动物假想祖先的线粒体基因组排列方式有所不同，假想的昆虫祖先的基因排列顺序为trnI-trnQ-trnM，4种蛱蝶科线粒体的基因排列顺序均为trnM-trnI-trnQ，这与其它已测出的26种鳞翅目昆虫的基因排列顺序是一致的。对蛱蝶科昆虫比较发现，基因间隔和基因重叠区数目长度各有差异，但是蛋白质编码基因对ATP8/ATP6之间都是重叠了7bp。
　　3、细带闪蛱蝶A.metis线粒体基因组的蛋白质编码基因除了COI以CGA作为起始密码外，其余蛋白质基因均以ATN作为起始密码子。在细带闪蛱蝶A.metis中多数采用完整的三联密码子TAA、TAG作为终止密码子，少数基因使用不完整的T。
　　4、蛱蝶科昆虫蛋白质基因的密码子使用和氨基酸使用均具有极强的偏向性，同义密码子NNA和NNU的使用率很高，细带闪蛱蝶A.metis氨基酸组中Leu、Ile、Phe、Ser这四釉氨基酸的含量相对较高，占到总氨基酸含量的45.50％。
　　5、细带闪蛱蝶A.metis线粒体基因组中22个tRNA的基因排列顺序与其它3种蛱蝶科昆虫都是相同的，基因长度在61-74 bp之间，除tRNASer(AGN)的二级结构缺少了DHU臂外，其余21个tRNA基因都可折叠成完整的三叶草结构，碱基错配主要是G=U和U=U。
　　6、对于线粒体基因组蛋白质编码基因，每种氨基酸使用频率最高的密码子并不总是严格对应线粒体基因组tRNA的反密码子。
　　7、蛱蝶科昆虫AT富含区存在以下结构特点:线粒体基因组大小的变化与非编码序列长度密切相关;在rrnS基因的下游有一段由“ATAGA”或“ATAGAA”引导的保守的17-19 bp多聚T结构;在这4个蛱蝶科物种中都发现含有长短不一的串联重复单元;以上4种蛱蝶科昆虫线粒体基因组位于tRNAMet基因上游的AT富含区都有6-11 bp的多聚T结构。
　　8、本研究基于线粒体基因组13个蛋白质编码基因的核苷酸序列构建了27种鳞翅目昆虫的系统发育树，经贝叶斯法(Bayesian)及最大似然法(Maximum Likelihood)进行系统发育组学分析，所得拓扑结构类似，结果显示蚕蛾总科、尺蛾总科、夜蛾总科、螟蛾总科聚在一起，它们之间的亲缘关系较近，之后再与凤蝶总科聚在一起，最后与卷蛾总科聚在一起。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 基因组学研究概况

1．1．1 基因组学简介

1．1．2 比较基因组学与线粒体基因组

1．2 六足动物线粒体基因组的结构及特征

1．2．1 线粒体基因组的基本特征

1．2．2 蛋白质编码基因(PCGs)

1．2．3 tRNA基因

1．2．4 rRNA基因

1．2．5 A+T丰富区

1．2．6 六足动物线粒体DNA的遗传密码

1．2．7 线粒体基因组的基因重排

1．3 线粒体基因组研究技术和方法

1．3．1 mtDNA序列扩增

1．3．2 线粒体基因组的测序

1．3．3 线粒体基因组序列数据的拼接及注释

1．4 蛱蝶科昆虫及其线粒体基因组研究进展

1．4．1 蛱蝶科昆虫简介

1．4．2 蛱蝶科昆虫的系统学发育研究

1．5 研究目的及意义

第二章 材料和方法

2．1 研究材料、试剂和仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 技术路线

2．2．2 总基因组DNA的提取及检测

2．2．3 PCR引物设计

2．2．4 线粒体基因组DNA的扩增及产物纯化

2．2．5 序列测定

2．2．6 序列数据初步分析

第三章 细带闪蛱蝶线粒体基因组分析

3．1 线粒体全基因组的组成

3．1．1 基因结构和基因顺序

3．1．2 基因间隔与重叠

3．1．3 碱基组成特征

3．1．4 蛋白质编码基因分析

3．1．5 蛋白质基因碱基组成偏向性

3．1．6 蛋白质编码基因密码子使用情况

3．1．7 蛋白质基因氨基酸组成

3．1．8 tRNA基因及结构预测

3．1．9 rRNA基因注释及分析

3．1．10 控制区

第四章 蛱蝶科昆虫线粒体基因组的比较研究

4．1 线粒体基因组结构的比较研究

4．2 密码子的使用

4．3 线粒体基因组的碱基组成特点比较

4．4 tRNA和rRNA

4．5 控制区

第五章 系统发育研究

5．1 系统发育研究中所用类群

5．2 系统发育分析方法

5．3 系统发育分析

结论与展望

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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