重组人可溶性突变体BAFF蛋白的制备及生物学活性研究

摘要

B细胞活化因子(B cell activating factor belonging to the TNF family, BAFF)是肿瘤坏死因子配体家族的新成员，是调节B细胞免疫的重要细胞因子；在体内，它以膜结合型和可溶型两种活性形式存在，可溶性蛋白由152个氨基酸(134～285)组成，是膜结合型的BAFF在体内蛋白酶的作用下水解释放得到的胞外区片段，也是其发挥功能的主要区域。BAFF作为一种B淋巴细胞共刺激因子，能够促进B细胞增殖、活化、分化及抗体的产生，延长B细胞的存活；在BAFF转基因鼠，出现类似人系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)和Sjogren's综合征等自身免疫病的表现；BAFF过表达也在SLE、类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）、Sjogren's综合征和一些B细胞肿瘤患者中发现。因此，BAFF作为一种重要的免疫调节分子，在维持B细胞动态平衡中发挥关键作用；BAFF的异常表达在B细胞恶性增殖性疾病和异常活化性疾病中发挥重要的致病作用。BAFF可与BAFF-R、TACI和BCMA三个受体特异性结合而发挥其生物学作用，其中BAFF-R是其特异受体，只能与BAFF结合，BAFF-R与BAFF之间的亲和力远大于其它两个受体。另外，研究发现，BAFF的受体不仅在正常B细胞上表达，而且在淋巴瘤和自身免疫病等恶性B细胞和异常增殖的B细胞有较高水平的表达。BAFF受体表达的细胞特异性，提示BAFF及其受体可作为B细胞恶性增殖性疾病和异常活化性疾病的重要的潜在治疗靶点。
　　 目的：
　　 鉴于BAFF及其受体有望成为治疗相关性疾病的新靶点。为此我们根据编码人sBAFF氨基酸的核苷酸序列，对其cDNA序列进行人工突变，得到了可溶性突变体BAFF(soluble mutant BAFF,smBAFF)编码序列，构建了相应重组表达质粒，表达、纯化了重组人smBAFF(recombinant human smBAFF,rh-smBAFF)。通过rh-smBAFF与BAFF竞争性结合BAFF受体的初步研究，探讨其作为BAFF拮抗剂治疗B细胞淋巴瘤和系统性红斑狼疮等B细胞异常增生活化性疾病的可行性。
　　 方法：
　　 1.rh-smBAFF基因合成和克隆：根据BAFF蛋白质结构及功能域分析和大肠杆菌密码子偏性，合成人smBAFF基因并克隆至pUC57获得重组载体pUC57-smBAFF。依据smBAFF基因序列设计包含NdeI和XhoI位点的特异性引物，经PCR扩增得到目的基因片段，将目的基因片段插入到pMD19-T克隆载体，构建重组克隆质粒pMD19-T/smBAFF。行菌落PCR筛选及酶切鉴定阳性克隆，对目的基因片段进行DNA序列测定。
　　 2.表达载体的构建和鉴定：纯化重组克隆质粒pMD19-T/smBAFF，经NdeI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离并纯化smBAFF基因片段，将其插入到经相应酶切的表达载体pQE-T7-2上，转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR鉴定阳性重组表达质粒。
　　 3.rh-smBAFF的表达鉴定：重组质粒pQE-T7-2/smBAFF转化BL21感受态菌株，挑取单克隆菌落扩增至对数生长期，经IPTG诱导后，SDS-PAGE分析和Western blot鉴定重组蛋白。
　　 4.rh-smBAFF表达形式的鉴定：大量诱导表达rh-smBAFF，分别收集细菌裂解上清和包涵体沉淀，行SDS-PAGE分析蛋白表达形式。
　　 5.rh-smBAFF纯化：在变性条件下采用Ni2+-NTA亲和层析法对目的蛋白进行纯化，行SDS-PAGE分析目的蛋白纯度，变性的目的蛋白经尿素浓度逐渐降低透析液透析复性，超滤浓缩目的蛋白。
　　 6.受体结合实验：用免疫荧光技术检测rh-smBAFF与B淋巴细胞结合能力。
　　 7.细胞增殖实验：用CCK-8法检测rh-smBAFF对sBAFF促B细胞增殖的竞争抑制作用。
　　 采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。
　　 结果：
　　 1.rh-smBAFF表达载体、菌株的构建：优化的人smBAFF基因序列经序列分析与预期一致。插入原核表达载体pQE-T7-2，构建了原核表达质粒pQE-T7-2/smBAFF。原核表达质粒转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导、SDS-PAGE分析，结果显示诱导后的重组菌株在17KDa处出现明显蛋白条带，与目的蛋白的大小相同，经凝胶图像扫描分析显示目的蛋白约占菌体总蛋白的40％。Western blot结果显示重组蛋白与抗人BAFF多克隆抗体和抗His-Tag多克隆抗体均能发生特异性反应，表明获得的重组蛋白为特异性smBAFF蛋白。
　　 2.rh-smBAFF的分离纯化：重组菌株扩增、IPTG诱导，分离细菌裂解上清和包涵体，经SDS-PAGE分析显示，重组蛋白主要位于包涵体中。变性裂解包涵体，经Ni2+-NTA亲和层析法纯化目的蛋白，行SDS-PAGE和凝胶图像扫描分析，smBAFF蛋白纯度达90%以上。
　　 3.rh-smBAFF特异性结合B细胞：细胞免疫荧光显示，重组smBAFF蛋白能与B细胞表面受体有特异性结合能力。
　　 4.rh-smBAFF对sBAFF促B细胞增殖的抑制作用：经CCK-8法检测显示，th-smBAFF失去刺激B细胞增殖的作用，且能抑制sBAFF对B细胞增殖的刺激作用。
　　 结论：
　　 成功构建了rh-smBAFF原核表达载体和高效稳定表达工程菌株；纯化的重组蛋白rh-smBAFF无B细胞增殖活性但保留了良好的B细胞结合活性，且具有竞争性抑制sBAFF促进B细胞增殖的作用，为其作为靶向载体在B细胞恶性增殖性疾病及自身免疫性疾病治疗中的应用提供了实验依据。

目录

研究生导师和课题指导小组成员介绍

声明

摘要

主要符号表

前言

第一部分 人smBAFF基因克隆及序列分析

材料

方法

结果

小结

第二部分人smBAFF基因在大肠杆菌中的表达、鉴定及重组蛋白的纯化

材料

方法

结果

小结

第三部分 人smBAFF重组蛋白的生物学活性测定

材料

方法

结果

小结

全文讨论

结论

参考文献

综述

攻读硕士学位期间的研究成果

致谢