八肋游仆虫酸性核糖体蛋白P1的性质研究

摘要

真核生物酸性核糖体磷酸化蛋白简称P蛋白，包括P0、P1和P2三类。它们共同组成一个五聚体的柄状复合物位于核糖体60S大亚基上，并与26S/28S rRNA的一个保守结构域共同形成 GTPase活性中心，参与蛋白质的合成。这些蛋白的等电点通常位于酸性范围(PI3-5)内，且可以被一些蛋白激酶(如CK2、PK60S、RAP)磷酸化。柄状复合物作为核糖体上的重要结构，最重要的作用是与转录因子结合参与调节蛋白质的合成。
　　八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)是一种淡水单细胞原生动物，细胞核具有双态性，包括一个大核和一个小核。除了核结构的特殊性外，游仆虫在基因表达调控方面也有特殊之处，可以将UAA和UAG作为终止密码子，而将UGA编码为半胱氨酸或硒代半胱氨酸。
　　为了探讨单细胞真核生物核糖体柄状复合物的组成形式及在蛋白质合成中的作用，本研究以八肋游仆虫(E. octocarinatus)为实验材料，通过生物信息学方法，分析八肋游仆虫基因组及转录组数据，找到2个酸性核糖体蛋白P1基因，从DNA和cDNA中都扩增到这2个P1基因，命名为EoP1A和EoP1B，将2个基因克隆后分别构建重组表达质粒pET28a-P1A和pGEX-6P-1-P1B，在E. coli BL21(DE3)中表达并分别纯化。利用 pull-down分析了EoP1A和EoP1B之间的相互作用。利用核磁共振(NMR)检测EoP1A的体外磷酸化作用。获得的主要结果如下：
　　1.八肋游仆虫EoP1A和EoP1B基因的克隆及分析
　　分别以八肋游仆虫 cDNA和大核基因组为模板，经 PCR得到两个基因的开放阅读框(ORF)及基因全序列，序列分析显示，EoP1A基因和 EoP1B基因全长分别为803 bp和641 bp，两个基因均不含内含子，开放阅读框均为357 bp，两个基因编码区的核苷酸序列相似性为76％，氨基酸序列相似性为81%。多序列比对结果显示EoP1A和EoP1B的N端存在可以形成α-helix的几段比较保守的氨基酸序列，但N端起始区比其他生物的相应区域多出了8个氨基酸；C端不存在多数生物中所具有的保守的氨基酸序列，其 C端比其他生物多了5-7个氨基酸，最后3个氨基酸为DEY。
　　2. EoP1A和EoP1B蛋白的表达与纯化
　　将 EoP1A和EoP1B基因分别与表达质粒 pET28a和 pGEX-6P-1连接，成功构建重组表达质粒pET28a-EoP1A和pGEX-6P-1-EoP1B，在E. coli BL21中表达并分别纯化，获得较高纯度的 EoP1A和 EoP1B蛋白。获得的重组蛋白均经过 Western印迹检测。
　　3. EoP1A和EoP1B的相互作用分析
　　利用pull-down方法，检测了EoP1A和EoP1B的相互作用，结果表明八肋游仆虫P1的两个亚型在体外可以进行相互作用。
　　4. EoP1A蛋白体外磷酸化作用的检测
　　利用 NetPhos2.0软件在线分析 EoP1A蛋白氨基酸序列，预测潜在的磷酸化位点；通过定点突变，构建突变体，体外表达并纯化突变体蛋白；同时在体外表达并纯化蛋白激酶 CK2(CK2α和CK2β)；通过核磁共振(NMR)检测 EoP1A蛋白体外磷酸化作用，结果显示EoP1A蛋白被CK2磷酸化的位点位于蛋白N端的Ser8。
　　5.八肋游仆虫P蛋白之间的相互作用。
　　通过 pull-down分析了八肋游仆虫 EoP1A、EoP1B与 EoP2之间的相互作用，初步结果表明EoP1A和EoP1B均不能与EoP2相互作用。
　　综上所述，八肋游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白 P1基因有两个亚型(EoP1A和EoP1B)。与其他生物的 P1蛋白相比，游仆虫两个 P1蛋白 N端均插入了8个氨基酸，且 C端不保守；通过 pull-down实验证明 EoP1A和 EoP1B存在相互作用。核磁共振(NMR)结果显示 EoP1A可以在体外被 CK2磷酸化，磷酸化位点位于 N端的Ser8位。Pull-down并未检测到EoP1A、EoP1B与EoP2间的相互作用。这些结果为进一步研究八肋游仆虫核糖体蛋白柄状结构复合物组成形式提供了实验基础。

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第一章 文献综述

1核糖体与蛋白质合成

2 酸性核糖体磷酸化蛋白

3 CK2与核糖体蛋白

4 八肋游仆虫

5本课题研究思路及意义

第二章 八肋游仆虫核糖体蛋白P1基因的克隆与序列分析

1引言

2材料与方法

3实验结果

4讨论

第三章 八肋游仆虫核糖体蛋白EoP1A和EoP1B的表达纯化及相互作用的检测

1引言

2材料与方法

3实验结果

4讨论

第四章八肋游仆虫核糖体蛋白EoP1A磷酸化位点分析

1引言

2材料与方法

3实验结果

4 讨论

总结与展望

总结

展望

参考文献

附录1略语表

附录2本研究构建的重组表达质粒表

附录3常用试剂配制

附录4主要仪器设备

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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