飞蝗几丁质降解酶基因的异质性表达及酶学特性分析

摘要

几丁质是由N-乙酰葡萄糖胺残基通过β-1，4糖苷键连接而成的直连多糖高聚物，主要存在于昆虫的外骨骼、围食膜、肠道和气管以及植物和真菌的细胞壁中，是自然界中仅次于纤维素的第二大生物多聚物。昆虫几丁质降解酶主要分为糖苷水解酶18家族的几丁质酶（Chitinase,Cht）和糖苷水解酶20家族的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（N-Acetylglucosaminidase,NAG）两种，这两种酶通过协同作用可将几丁质降解为N-乙酰氨基葡萄糖单体。几丁质酶是一种内切酶，可降解几丁质为几丁寡糖，而N-乙酰氨基葡萄糖苷酶是一种外切酶，可将几丁寡糖从非还原端水解为N-乙酰氨基葡萄糖单体。几丁质降解酶广泛存在于昆虫的中肠、蜕皮液以及一些昆虫的毒腺中，对昆虫生长发育过程中几丁质的代谢起着重要的调控作用。几丁质酶和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作为潜在的杀虫剂靶标、几丁质生物垃圾的降解和生产N-乙酰氨基葡萄糖的酶工具而受到广泛的关注。
　　本研究主要是将飞蝗Ⅰ型几丁质酶（LmCht5-1和LmCht5-2）和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（LmNAG1）通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在SF9细胞中进行异质性表达，测定温度和pH对酶活性的影响，以及酶的动力学参数。并通过胶状几丁质结合实验比较LmCht5-1和LmCht5-2对胶状几丁质的结合能力，从而确定几丁质结合结构域（CBD）的功能。主要研究内容分为以下三个部分：
　　一、飞蝗LmCht5-1、LmCht5-2和LmNAG1在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达及纯化
　　将飞蝗Ⅰ型几丁质酶（LmCht5-1和LmCht5-2）和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（LmNAG1）通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在SF9细胞中进行异质性表达。设计带有酶切位点、起始密码子、终止密码子以及6×His标签的PCR引物扩增目的片段，构建到pFastbacTMDual真核表达载体上，之后将重组载体转化到DH10感受态细胞中，得到重组Bacmid杆粒，将重组Bacmid杆粒转染SF9细胞进行真核表达。利用6×His标签蛋白与Ni-NTA柱的亲和性对所表达蛋白进行纯化。通过SDS-PAGE胶和WesternBlot对纯化后的目的蛋白进行检测。
　　二、飞蝗几丁质降解酶的酶学特性分析
　　获得纯化蛋白后，测定了酶的最适pH、pH稳定性、最适温度、热稳定性以及酶的动力学参数等。结果显示LmCht5-1和LmCht5-2具有相似的最适pH和温度（使用寡聚底物4MU-(GlcNAc)3时，二者的最适pH值为6，使用多聚底物CM-Chitin-RBV 时二者的最适pH值均为9，最适温度为40℃）。使用寡聚底物4MU-(GlcNAc)3测定酶的动力学参数时，LmCht5-1的Km值比LmCht5-2小，LmCht5-1的Kcat/Km值比
　　LmCht5-2大，相反，使用多聚底物CM-Chitin-RBV测定酶的动力学参数时，LmCht5-1的Km值比LmCht5-2大，LmCht5-1的Vmax/Km值比LmCht5-2小，说明LmCht5-1倾向于水解寡聚底物，而LmCht5-2则倾向于水解多聚底物。使用4MU-GlcNAc为底物测定LmNAG1的动力学参数时，LmNAG1的Km值为0.28±0.02mM，kcat/Km值为3215.12±61.98mM-1S-1，说明LmNAG1酶对底物4MU-GlcNAc有着很高的亲和性，且具有很高的催化效率。所以我们得出结论：在蝗虫体内，LmCht5-1可能主要负责降解寡聚几丁质，LmCht5-2可能主要负责降解多聚几丁质，而LmNAG1主要负责将LmCht5-1和LmCht5-2的降解产物通过外切水解作用降解为N-乙酰氨基葡萄糖单体。
　　三、LmCht5-1和LmCht5-2的几丁质结合特性分析
　　LmCht5-1和LmCht5-2在结构上都具有信号肽、一个催化域和一个连接区，此外LmCht5-1比LmCht5-2多一个CBD区（Chitinbindingdomain）。本研究通过Arakane等[1]所描述的几丁质结合特性研究方法对飞蝗几丁质酶LmCht5-1和LmCht5-2的几丁质结合特性进行了研究，得出结论：含有CBD区的LmCht5-1可以和胶状几丁质紧密结合，而不含CBD区的LmCht5-2则几乎不能结合胶状几丁质。
　　本研究首次将飞蝗Ⅰ型几丁质酶（LmCht5-1和LmCht5-2）和β-N-乙酰葡萄糖苷酶(LmNAG1)构建于真核表达载体上进行表达和纯化，并对纯化蛋白进行了最适pH、pH稳定性、最适温度、热稳定性以及酶反应动力学参数的测定。进一步明确了LmCht5-1、LmCht5-2和LmNAG1的理化特性，为利用几丁质降解酶进行害虫防治提供了理论依据。

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第一章文献综述

1.1 飞蝗概述

1.2 昆虫几丁质、几丁质酶和β-N-乙酰葡萄糖苷酶

1.3酶活测定方法及其应用

1.4研究目的和意义

1.5课题来源及研究内容

第二章飞蝗LmCht5-1、LmCht5-2和LmNAG1的表达及纯化

2.1引言

2.2实验材料及试剂

2.3实验方法

2.4实验结果

2.5 讨论

第三章飞蝗几丁质降解酶的酶学特性分析

3.1引言

3.2实验材料及试剂

3.3 实验方法

3.4结果

3.5讨论

第四章LmCht5-1和LmCht5-2的几丁质结合特性分析

4.1引言

4.2实验材料及试剂

4.3实验方法

4.4结果

4.5讨论

全文总结

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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