在C.elegans中rBTI延缓衰老及对衰老相关疾病的影响

摘要

荞麦是一种药食同源的小杂粮作物，含有丰富的营养物质及生物活性成分，常食荞麦可降低罹患高血压、高血脂、糖尿病、癌症等风险。荞麦胰蛋白酶抑制剂（buckwheat typsin inhibitor，BTI）是一种提取自荞麦种子的含有69个氨基酸的小分子多肽，分子量为7.9kD，具有很好的水溶性，属于PotatoⅠ型蛋白酶抑制剂家族，特异性抑制胰蛋白酶活性。为了方便BTI的研究和应用，本课题组利用基因克隆技术构建了含有BTI基因的表达质粒pExSecI-BTI经大肠杆菌原核表达和离子交换层析，获得了重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat typsin inhibitor,rBTI），rBTI和天然提取BTI具有相同的氨基酸序列及生物活性。
　　课题组先前的研究表明，rBTI对Hep G2，EC9706，K562，HL60等实体瘤细胞具有很好的抑制增殖作用，在Hep G2中rBTI可以通过诱导活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的增加促进线粒体自噬，并且可以将细胞周期阻滞在G0/G1期，使细胞单次分裂周期延长;近期在黑腹果蝇中的实验证明，rBTI可以通过增强黑腹果蝇抗氧化能力延长其寿命，但其具体机制尚不明确。本研究利用经典模式生物秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans，C.elegans)，探究了rBTI对衰老及衰老相关疾病的影响及其作用机制，主要研究内容和结果如下:
　　1、rBTI对C.elegans健康寿命、摄食及运动能力的影响
　　利用五氟尿嘧啶(5-fluoro-2'-deoxyuridine，FUdR)寿命检测法检测rBTI对N2野生型C.elegans寿命的影响，结果显示，和对照组相比，在2.5-10μM的范围内rBTI能明显延长虫体寿命，且具有浓度依赖性;对衰老相关指标检测表明，rBTI明显降低了衰老相关的β-半乳糖苷酶活性及线虫肠道褐脂质积累;同时，显微观察统计结果显示rBTI不会明显影响年轻虫体运动及咽抽速率，但改善了老年虫体的运动能力，表明rBTI延长了C.elegans的健康寿命。
　　2、rBTI延长C.elegans寿命的作用方式
　　采用反相高效液相色谱法、耗氧量检测、荧光探针、酶活检测及胡桃醌诱导氧化应激等方法检测显示，rBTI可以增强线虫体内AMP与ATP的比率，诱导其呼吸作用和ROS产生的增强。增强的ROS可激活虫体内源性抗氧化防御系统的活性，产生反馈保护作用，降低ROS的含量，进而增强虫体抗氧化应激能力。利用ROS抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)的检测显示，当ROS信号被抑制后，rBTI失去了延长虫体寿命的能力，表明rBTI延长寿命的作用依赖于瞬时ROS信号产生，该机制和热量限制(calorie restriction，CR)延长寿命的机制非常相似，据此我们认为:rBTI延长寿命的功效可能通过一种热量限制模拟(calorie restriction mimetic，CRM)的方式发挥作用。
　　利用qRT-PCR方法检测显示，rBTI下调了胰岛素/类胰岛素生长因子信号（insulin/IGF-1signaling，IIS）通路各组分的转录水平;同时转基因C.elegans及qRT-PCR等方法检测显示，rBTI可以增强IIS通路主要转录因子DAF-16的转录活性，增强其靶基因的表达，但不影响IIS通路中另外两个转录因子HSF-1和SKN-1的转录活性。
　　突变体线虫品系寿命检测显示，rBTI不能延长daf-2和daf-16突变体线虫寿命，表明rBTI介导的寿命延长依赖于daf-2和daf-16，即依赖于IIS通路;同时，荧光探针检测显示，在daf-2、daf-16突变体中，rBTI不能诱导瞬时ROS信号产生，但是当用NAC抑制ROS信号产生时，rBTI仍能够下调IIS通路，表明rBTI介导的ROS信号诱导同样依赖于IIS通路。
　　3、rBTI对C.elegans相关代谢的影响
　　与CR对代谢影响相似，qRT-PCR及酶活检测显示，rBTI降低了C.elegans中参与糖酵解过程相关酶活性，增强了虫体脂肪酶活性，同时油红染色结果显示，和对照组相比，rBTI处理组虫体中脂肪积累明显减少，表明rBTI可以诱导C.elegans体内糖代谢产能向脂代谢产能的转变;此外，转基因线虫及qRT-PCR显示，rBTI能够增强C.elegans自噬过程。
　　4、rBTI延长寿命的作用与其本身分子结构的关系
　　根据rBTI的结构特点和活性部位，通过定点突变技术，分别对rBTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变，获得了4种rBTI突变体，分别命名为rBTI-R45A、rBTI-R45F、rBTI-W53R和rBTI-P44T。C.elegans寿命检测实验表明失去胰蛋白酶抑制活性的rBTI-R45A、rBTI-R45F及胰蛋白酶抑制活性显著升高的rBTI-P44T均不同程度失去了延长寿命的功能。同时，转基因线虫荧光显微观察及qRT-PCR显示，四种突变体均不能增强DAF-16的转录活性，表明rBTI延长寿命及增强DAF-16转录活性的功能均依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性，活性位点突变会导致其相应的延长寿命功能减弱或丧失。
　　5、rBTI对衰老相关疾病的影响及其机制
　　阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）是最常见的一种神经退行性疾病，其发生发展与衰老密切相关。虽然AD的发病机制还不太清楚，但普遍认为β样淀粉蛋白(β-amyloid，Aβ)诱导的毒性是AD发病的主要原因。研究表明具有延寿效应的物质能够不同程度的保护对抗AD，本研究中利用一种能够表达人类Aβ3-42的AD模型线虫CL4176检测了rBTI对AD的作用，并用western blot、免疫印迹、荧光染色、RNA干扰（RNA interference，RNAi）等方法初步探究了其作用机制，结果显示rBTI能够很好的减缓Aβ毒性诱导的AD线虫僵化速率，促进AD线虫自噬-溶酶体降解途径，降低其体内Aβ积累，但是对蛋白酶体降解途径没有明显影响，且和在N2野生型线虫中作用相似，rBTI保护效应的发挥依赖于转录因子DAF-16。这些数据表明rBTI不仅具有延缓衰老的效应，还是一种潜在的有效治疗AD的天然化合物。此外，在亨廷顿症(Huntington's disease，HD)模型线虫中的实验显示，rBTI同样能够减缓HD模型中多聚谷氨酰胺聚体及线虫的僵化表型，表明除了AD外，rBTI可能对另一衰老相关疾病HD也有有益作用。
　　综上所述，本研究证明，rBTI可以改善老年虫体的运动能力，延长C.elegans的健康寿命;类似于CR延长寿命效应，rBTI可通过下调IIS通路，诱导ROS短暂升高，进而激活DAF-16的转录活性，增强其下游靶基因的表达和抗氧化防御能力，最终使虫体寿命延长;rBTI可诱导线虫体内糖代谢产能向脂代谢产能转变;分别利用转基因线虫和AD模型线虫实验显示，rBTI不仅能增强C.elegans自噬过程，而且能通过促进自噬-溶酶体降解途径，适当对抗AD。这些结果为进一步开展生物活性物质在延缓衰老，对抗老年痴呆等疾病中的作用机理和应用研究奠定了良好的基础。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 衰老

1．1 衰老理论

1．2 热量限制

1．3 热量限制模拟

2 胰蛋白酶抑制剂概述

2．1 荞麦胰蛋白酶抑制剂

3 秀丽隐杆线虫

3．1 秀丽隐杆线虫中衰老调控相关通路

4 论文研究的背景及目的意义

第二章 rBTI对C．elegans健康寿命的影响

1 实验材料

1．1 线虫品系

1．2 实验试剂及仪器

2 实验方法

2．2 E．coli OP50培养

2．3 E．coli OP50增殖检测

2．4 秀丽隐杆线虫培养及相关方法

2．5 统计分析

3 实验结果

3．2 rBTI对C．elegans寿命的影响及最佳用药浓度的确定

3．3 rBTI对C．elegans衰老的影响

3．4 rBTI对C．elegans摄食及行为能力的影响

4 讨论

参考文献

第三章 rBTI延长C．elegans寿命的作用方式

1 实验材料

1．1 线虫品系

1．2 实验试剂及仪器

2 实验方法

2．4 胡桃醌氧化应激实验

2．5 mtDNA损伤检测

2．6 ROS定量

2．7 AMP／ATP比率检测

2．8 呼吸速率检测

2．9 线虫总RNA提取

2．10 实时定量PCR

2．11 DAF-16定位检测

2．12 突变体线虫品系寿命检测

2．13 统计分析

3 实验结果

3．2 rBTI对C．elegans内源性抗氧化防御系统的影响

3．3 rBTI对C．elegans体内AMP：ATP比率及呼吸作用的影响

3．4 ROS信号在rBTI延长寿命中的作用

3．5 rBTI下调IIS通路，增强DAF-16转录活性

3．6 daf-2、daf-16在rBTI介导的寿命延长中的作用

3．7 rBTI对daf-2突变体中ROS的影响

4 讨论

参考文献

第四章 rBTI对C．elegans相关代谢影响

1 实验材料

1．1 线虫品系

1．2 实验试剂及仪器

2 实验方法

2．1 2-NBDG摄取

2．2 能量代谢相关酶活性检测

2．4 油红染色

2．5 线虫总RNA提取

2．6 实时定量PCR

2．7 荧光显微观察

2．8 统计学分析

3 实验结果

3．3 rBTI对C．elegans脂肪酶活性及脂肪积累影响

3．4 rBTI对C．elegans自噬影响

4 讨论

参考文献

第五章 rBTI对C．elegans寿命影响与其分子结构的关系

1 实验材料

1．1 线虫品系

1．2 实验试剂及仪器

2 实验方法

2．1 rBTI突变体质粒的构建

2．2 突变体的原核表达及纯化

2．3 胰蛋白酶抑制活性分析

2．4 圆二色光谱分析

2．5 C．elegans寿命检测

3．1 rBTI及其突变体的表达与纯化

3．2 rBTI及其突变体抑制活性鉴定

3．3 圆二色光谱对比分析

3．3 rBTI及其突变体对C．elegans寿命的影响

3．4 rBTI及其突变体对转录因子DAF-16的影响

4 讨论

参考文献

第六章 rBTI对衰老相关疾病的影响及其机制

1 实验材料

1．1 线虫品系

1．2 实验试剂及仪器

2 实验方法

2．2 线虫僵化检测

2．3 RNA提取及实时定量PCR

2．7 蛋白酶体活性检测

2．8 溶酶体含量检测

3．1 rBTI延长了AD模型线虫寿命

3．2 rBTI延缓了AD模型线虫僵化表型

3．3 rBTI降低了AD模型线虫中Aβ积累

3．4 rBTI促进了AD模型线虫自噬-溶酶体降解途径的加强

3．5 自噬对于rBTI介导的僵化表型减缓是必须的

3．6 rBTI增强了AD模型线虫中DAF-16的转录活性

3．7 rBTI对HD模型线虫的影响

4 讨论

参考文献

小结与展望

缩略词

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

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