齐墩果酸通过miR-122/CyclinG1/MEF2D对肺癌细胞增殖影响的研究

摘要

目的:
　　齐墩果酸(OA)是一种从植物中提取的化合物，具有抗肿瘤活性。然而，OA对细胞周期抑制作用的机制还没有完全研究清楚。本研究设计通过几种肺癌细胞探讨OA引起与细胞周期相互作用的分子机制。CCNG1和MEF2D，两者是被公认的miR-122作用靶点，发现在OA作用后表达下调。维持CCNG1和MEF2D蛋白的正常表达可以抑制OA对肺癌细胞抗癌效应。本研究主要证实在肺癌细胞中OA能刺激miR-122转录调节因子表达，验证在肺癌细胞中OA所致的细胞周期阻滞是通过miR-122/CyclinG1/MEF2D途径，有助于阐释齐墩果酸抗肿瘤活性的分子机制。
　　方法:
　　(1)MTT法检测OA处理肺癌细胞系A549、NCI-H460、NCI-H1299以及肺癌原始细胞（Primary LC1和Primary LC1）的时间依赖增值率和剂量依赖增值率;
　　(2)Quantitative-PCR检测不同剂量和不同时间的OA处理的肺癌细胞系A549、NCI-H460、NCI-H1299、Primary LC1、Primary LC1和MRC-5细胞中miR-122的表达水平。
　　(3)通过使用miR-122阻断剂，降低miR-122的表达水平观察OA对肺癌细胞A549和Primary LC1的作用。
　　(4)为进一步探讨OA通过miR-122抑制肿瘤细胞增殖的作用，通过WesternBlot法检测OA处理过的肺癌细胞中CCNG1和MEF2D蛋白的表达水平。
　　(5)通过转染pcDNA3-CCNG1+pcDNAMEF2D至A549、Primary LC1细胞，观察OA对CCNG1和MEF2D蛋白的表达的影响。
　　(6)为进一步探讨OA是否增加miR-122的表达水平。Western Blot法检测不同时间段和不同剂量的OA处理过的A549细胞中HNF1α、HNF3β、HNF4α和HNF6蛋白的表达水平。
　　(7)通过癌细胞种植建立小鼠肺癌模型，通过不同剂量的OA处理种植小鼠，观察肿瘤细胞生长的体积，Quantitative-PCR法检测瘤体中miR-122的表达水平，Western Blot法检测瘤体中CCNG1和MEF2D蛋白的表达水平。
　　结果:
　　1. A549、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-H1299、Primary LC1、Primary LC1和MRC-5经过48h的培养，经过0ug/ ml、15ug/ ml、30ug/ ml、60ug/ ml剂量的OA处理，我们发现随着剂量的增加，出现细胞分化率的下降(A549，10.7-39％，NCI-H460,1.3-41.8％; NCI-H1299,2-50.4％; Primary LC11,4.5-64.3; PrimaryLC2，1.8-46.9％)，但是在MRC-5细胞系中没有明显改变。同时我们还发现经30ug/ml浓度的OA处理的细胞系，以时间依赖性抑制细胞生长，同时发现OA加入肺成纤维细胞系MRC-5中，增值速率没有明显的减少。
　　2. Quantitative-PCR检测A549、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-H1299、PrimaryLC1和Primary LC1经过48h的培养，经过0ug/ml、15ug/ml、30ug/ml、60ug/ml剂量的OA处理。与con组相比，细胞miR-122的表达水平在15ug/ml组时没有明显的变化，在30ug/ ml组时有明显变化（P＜0.05），在60ug/ ml组时有显著变化（P＜0.01）。同时我们还发现经30ug/ml的OA处理的细胞系，与con组相比，细胞miR-122的表达水平在24h组时没有明显的变化，在48h组时有明显变化(P＜0.05)，在72h组时有显著变化(P＜0.01)。
　　3. 通过使用miR-122阻断剂Antagomir，降低miR-122的表达水平，加入30ug/ml OA对A549和Primary LC1细胞的作用。研究结果显示:与Antagomir/OA（-/-）组相比，（-/+）组中miR-122的表达水平显著增高（P＜0.01），细胞增殖率明显下降(P＜0.05)，其中（+/-）组和(+/+)组没有明显变化。
　　4. 为进一步探讨OA通过miR-122抑制肿瘤细胞增殖的作用，经过0ug/ ml、15ug/ml、30ug/ml、60ug/ml剂量的OA处理A549和Primary LC1细胞Western Blot结果显示:与0ug/ml剂量组相比，细胞中CCNG1蛋白的表达水平在15ug/ml组时明显的降低(P＜0.05)，在30ug/ml组和60ug/ml组时有显著变化（P＜0.01）。与0ug/ml剂量组相比，细胞中MEF2D蛋白的表达水平在15ug/ ml、30ug/ ml组和60ug/ml组时有显著变化（P＜0.01）。经过不同时间的30ug/ml剂量的OA处理A549和Primary LC1细胞Western Blot结果显示:与0h组相比，细胞中CCNG1蛋白的表达水平在24h组时明显的降低(P＜0.05)，在48h组和72hl组时有显著变化(P＜0.01)。与0h组相比，细胞中MEF2D蛋白的表达水平在24h组时明显的降低(P＜0.05)，在48h组和72hl组时有显著变化(P＜0.01)。
　　5. 通过转染pcDNA3 CCNG1+pcDNAMEF2D至A549、Primary LC1细胞，经30ug/ml剂量的OA处理。Western Blot结果显示:与OA/pcDNA3-CCNG1+pcDNAMEF2D（-/-）组相比，（-/+）组和(+/+)组中CCNG1和MEF2D蛋白的表达水平显著增高（P＜0.01），（+/-）组中CCNG1和MEF2D蛋白的表达水平显著降低（P＜0.01）。细胞增值率显示:与OA/pcDNA3-CCNG1+pcDNAMEF2D（-/-）组相比，（-/+）组细胞增值率明显降低（P＜0.05），（+/-）组和(+/+)组没有明显变化。
　　6. Western Blot法检测经过0ug/ ml、15ug/ ml、30ug/ ml、60ug/ ml剂量的OA处理A549细胞48h培养，Western Blot结果显示:与0ug/ml剂量组相比，细胞中HNF1α、HNF3β、HNF4α蛋白的表达水平在15ug/ml没有明显的改变，其中HNF6蛋白有明显增加（P＜0.05）;在30ug/ml组和60ug/ml组时有显著的增加（P＜0.01）。经过30ug/ml剂量的OA处理培养0h、24h、48h和72h的A549细胞Western Blot结果显示:与0h组相比，细胞中HNF1α、HNF3β、HNF4α蛋白的表达水平在24h没有明显的改变，但是HNF6蛋白有明显增加（P＜0.05）;在48h组和72h组中HNF1α、HNF3β、HNF4α和HNF6蛋白的表达水平有显著的增加（P＜0.01）。
　　7. 通过体内试验，通过低剂量(40mg/kg)和高剂量(120mg/kg)的OA处理种植小鼠。肿瘤细胞生长的体积显示:与Con组相比，低剂量组肿瘤体积减少，高剂量组肿瘤体积明显降低(P＜0.05); Quantitative-PCR结果显示:与Con组相比，低剂量组瘤体中miR-122的表达水平没有明显改变，高剂量组中miR-122的表达水平显著增高（P＜0.01）。Western Blot结果显示:与Con组相比，低剂量组瘤体中CCNG1蛋白表达明显降低(P＜0.05)，高剂量组瘤体中CCNG1蛋白表达显著降低（P＜0.01）;低剂量组瘤体中MEF2D蛋白表达没有明显改变，高剂量组瘤体中CCNG1蛋白表达显著降低（P＜0.01）;
　　结论:
　　1. 齐墩果酸能降低肺癌细胞的增值率，能提高肺癌细胞的miR-122的表达。
　　2. 齐墩果酸能降低肺癌细胞中CCNG1和MEF2D蛋白表达水平
　　3. 齐墩果酸通过miR-122/CCNG1/MEF2D路径抑制肺部肿瘤作用。

目录

声明

摘要

第一章 前言

第二章 材料和方法

2．1 材料和方法

2．1．1 主要仪器

2．1．2 主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1．细胞系及培养方法和原代细胞采集

2．2．2．MTT法检测细胞生存率

2．2．3．反转录PCR(RT-PCR，reverse transcription PCR)

2．2．4．CCNG1-MEF2D载体表达

2．2．5．细胞中总蛋白提取方法

2．2．6．细胞蛋白浓度测定方法

2．2．7．Western Blot

2．2．8．转染pcDNA3-CCNG1+pcDNAMEF2D至A549、Primary LC1细胞

2．2．9．动物实验

2．3．统计学方法

第三章 结果

3．1 MTT法检测OA处理肺癌细胞系A549、NCI-H460、NCI-H1299以及肺癌原始细胞(Primary LC1和Primary LC1)的时间依赖增值率和剂量依赖增值率

3．2 Quantitative-PCR检测不同剂量和不同时间的OA处理的肺癌细胞系A549、NCI-H460、NCI-H1299、Primary LC1、Primary LC1和MRC-5细胞中miR-122的表达水平

3．3 通过使用miR-122阻断剂，降低miR-122的表达水平观察OA对肺癌细胞A549和Primary LC1的作用

3．4 为进一步探讨OA通过miR-122抑制肿瘤细胞增殖的作用，进一步通过Western Blot法检测OA处理过的肺癌细胞中CCNG1和MEF2D蛋白的表达水平

3．5 通过转染pcDNA3-CCNG1+pcDNAMEF2D至A549、Primary LC1细胞，观察OA对CCNG1和MEF2D蛋白的表达的影响

3．6 为进一步探讨OA是否增加miR-122的表达水平。Western Blot法检测不同时间段和不同剂量的OA处理过的A549细胞中HNF1α、HNF3β、HNF4α和HNF6蛋白的表达水平

3．7 通过癌细胞种植建立小鼠肺癌模型，通过不同剂量的OA处理种植小鼠，观察肿瘤细胞生长的体积，Quantitative-PCR法检测瘤体中miR-122的表达水平，Western Blot法检测瘤体中CCNG1和MEF2D蛋白的表达水平

第四章 讨论

4．1 齐墩果酸(OA)抑制mRNA122基因的表达对肺癌细胞的抑制

4．2 提高CCNG1和MEF2D蛋白水平的表达可以降低肺癌细胞的增殖率

第五章 结论

参考文献

综述 齐墩果酸通过miR-122／Cyclin G1／MEF2D对肺癌细胞增殖影响的研究

攻读学位期间取得的研究成果

致谢