浮游细菌遗传多样性分析的T-RFLP方法研究

摘要

该论文对近年来在国外微生物遗传多样性研究中发展迅速的T-RFLP方法进行探索,目的在于掌握其原理、方法和应用,以及优缺点,以便应用到微生物分子生态这的研究中去.该研究将T-RFLP方法应用于现场采样、液体和平板培养的细菌.对方法中各个步骤,包括DNA提取与纯化、PCR引物的选择和反应条件的确定、限制性酶切和产物的纯化,以及最终酶切片段的分离和检测进行了摸索.研究结果表明:DNA提取和PCR的空白试验表明,本方法容易受到污染的影响,对实验材料和无菌操作的要求必须严格.从平板培养样品的T-RFLP图谱判断它们属于至少3种不同的类群;湖水样品0.2μm膜样图谱表明湖水中自由的生活细菌至少包括22个不同的类群.湖水中吸附于颗粒的细菌至少有4个类群.自由生活和吸附于颗粒的细菌类群组成存在显著的差别.

目录

文摘

英文文摘

前言

1综述分子生物学技术在水域微生物多样性研究中的应用

1.1分子杂交法

1.2聚合酶链式反应法(PCR)

1.3克隆基因文库分析法

1.4基因指纹图谱技术

1.4.1单链构象多态性法(SSCP)

1.4.2变性梯度凝胶电泳法(DGGE)

1.4.3温度梯度凝胶电泳法(TGGE)

1.4.4限制性酶切片段长度多态性法(RFLP)

1.4.5限制性酶切末端片段长度多态性法(T-RFLP)

1.5不同分子生物学方法的联合研究

2材料与方法

2.1现场采样地点

2.2材料和试剂

2.3仪器

2.4现场水样的采集和处理

2.5微生物的培养和细胞收集

2.5.1大肠杆菌的液体培养和细胞收集

2.5.2湖水中细菌的稀释、培养、分离和计数和收集

2.5.3琼脂平板培养

2.6基因组DNA的提取

2.6.1细菌液体培养物基因组DNA的提取

2.6.2滤膜样品(现场采样)的基因组DNA提取

2.7琼脂糖凝胶电泳

2.8聚合酶链式反应

2.8.1引物的选择

2.8.2 PCR反应体系组成和反应条件

2.8.3 PCR产物的检测和纯化

2.9 PCR产物的限制性酶切和纯化

2.9.1 PCR产物的限制性酶切

2.9.2酶切产物的纯化

2.10分离酶切片段-T-RFLP图谱

3结果与讨论

3.1 DNA提取

3.2 PCR

3.2.1 PCR引物的选择

3.2.2 PCR污染的控制

3.2.3 PCR的效率

3.2.4 PCR产物的纯化

3.3酶切片段的分离和末端片段的检测

3.3.1空白试验、精确度和大肠杆菌T-RFLP图谱的预测和验证

3.3.2湖水细菌分离、纯培养菌株的检验

3.3.3湖水膜样T-RFLP分析

3.4 T-RFLP方法与相应分析策略的优点与存在的问题

致谢

4参考文献

附表1根据MspI-T-RFLP数据分析RDP数据库中与湖水0.2-1μm膜样相似的微生物类群

附表2根据RsaI-T-RFLP数据分析RDP数据库中与湖水1μm膜样相似的微生物类群