大菱鲆（Scophthalmus maximus）病毒性出血病病毒基因克隆及序列分析

摘要

2002年,在山东省沿海的养殖大菱鲆中发生了一种出血性疾病,史成银等在病鱼组织切片中发现了虹彩病毒样粒子并怀疑该病为虹彩病毒引起的.我们在农业部海洋生物资源可持续利用重点开放实验室基金课题资助下,重点进行了病毒的基因文库的构建和部分序列分析的研究,建立了病毒的部分DNA文库,测定了病毒的部分序列并进行了序列的分析,同时我们还对病毒粒子进行了初步的SDS-PAGE电泳分析.利用已有的基因库中虹彩病毒的序列信息,根据比对的结果,选取了虹彩病毒基因组中的较为保守的区域作为模板,设计了多对针对虹彩病毒的PCR特异引物.这些引物没有从患病的大菱鲆提取的DNA中扩增出理论长度的片段.对扩增出的明显小于理论长度的PCR产物测序后,测得的序列在Genbank中进行多序列比对,没有发现明显同源的序列.表明患病鱼体内存在的病毒同基因库中存在的虹彩病毒序列间有差异.利用差速离心和蔗糖密度梯度离心的方法提取了病鱼组织中的病毒.酚抽提法提取了病毒提取物中的核酸,酶切分析表明病毒的遗传物质是双链DNA.

目录

摘要

Abstract

0前言

1鱼类虹彩病毒研究进展

2病毒的提纯、定量和初步SDS-PAGE分析

2.1材料和方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.2结果和分析

2.2.1病毒的提纯

2.2.2病毒的定量

2.2.3 SDS-PAGE分析

2.3讨论

3 PCR方法检测患病鱼中的病毒

3.1材料和方法

3.1.1材料和设备

3.1.2方法

3.2结果和分析

3.2.1设计的引物

3.2.2 PCR的结果

3.2.3 PCR产物的测序结果

3.3讨论

4病毒基因组DNA的制备和初步酶分析

4.1材料和方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果

4.2.1病毒DNA的抽提

3.2.2病毒核酸的初步鉴定

4.2.3病毒DNA的限制性内切酶图谱

4.2.4病毒DNA Pst I酶切图谱分析

4.2.5病毒DNA分子量的计算

4.2.6酶切图谱的比较

4.3讨论

5病毒的部分基因文库的构建和部分序列的分析

5.1材料和方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果

5.2.1物理方法处理的DNA片段

5.2.2酶切处理的质粒DNA

5.2.3感受态大肠杆菌的转化效率

5.2.4 PCR方法鉴定阳性克隆结果

5.2.5提取质粒鉴定阳性克隆

5.2.6序列测定结果

5.2.7序列分析结果

5.2.8几种不同虹彩病毒的遗传距离分析

5.3讨论

6 PCR、点杂交法和原位杂交

6.1材料和方法

6.1.1材料

6.1.2实验方法

6.2结果和分析

6.2.1设计的核酸探针引物的分析结果

6.2.2温度梯度PCR

6.2.2 PCR结果

6.2.3核酸探针的合成和产量

6.2.4点杂交结果

6.2.5原位杂交

6.3讨论

7小结

参考文献

附录一.本论文所使用的试剂配制

附录二

致谢