应用双特异分子探针技术对圆海链藻（Thalassiosira rotula）进行定性定量检测研究

摘要

对海洋浮游植物进行分离、纯化、种类鉴定和定性定量检测是浮游植物研究中最重要的工作之一。对于浮游植物的检测与鉴定，传统的研究方法为形态学观察，随着现代科技的发展，一些先进的技术已经应用到浮游植物检测中，比如核酸杂交技术、分子免疫技术、实时荧光定量PCR及流式细胞术，另外HPLC技术也应用到浮游植物检测中来。目前利用分子生物学技术已经可以直接对单个浮游植物细胞进行操作。当前研究的热点是应用核酸探针技术对浮游植物进行定性定量分析，特别是原位杂交和三明治杂交在浮游植物检测中应用比较广泛。 本研究对圆海链藻进行了DNA的提取与纯化、rDNA序列扩增、克隆与测序；并基于一种全新的浮游植物检测技术——双特异分子探针技术，设计出一套分子探针；通过对各探针的使用浓度、探针标记方法的选择、酶切温度对特异性的影响以及样品与处理方式对检测信号的影响等实验条件的探讨与优化，建立了圆海链藻的稳定可靠的定性定量检测方法；通过核酸酶降解实验验证了该技术中与寡核苷酸探针进行杂交的靶物质主要是RNA；并进行了该方法的探针特异性实验、标准曲线的建立以及模拟样品的检测；另外对藻细胞保存方式对检测信号的影响以及整个细胞生长周期内检测信号的变化进行了探讨。 研究结果表明，扩增所得到的圆海链藻核糖体小亚基基因序列长为1787bp；经过特异性验证，证明本研究设计的针对圆海链藻的双特异分子探针(抓捕探针、S1探针、连接探针和信号探针)具有很好的特异性，能鉴定到种；对RNase和DNase处理前后的信号值进行的比较实验结果证明，在液相体系中与寡核苷酸探针特异杂交的目的核酸大部分为RNA；样品预处理方式对结果的影响实验证明，细胞裂解液直接杂交较之提纯RNA后杂交方法要快速、简洁、稳定的多，故接下来的实验中选择细胞裂解液直接杂交方法；按照前面所建立的实验方法建立的圆海链藻检测标准曲线方程为y=0.0019x-0.0284，其中x代表目的细胞数，y代表信号值，R2=0.995，具有很好的相关性，并且批内标准偏差(n=4)比较小，说明该检测曲线具有较高的稳定性，最低可检测到88个目的藻细胞；模拟样品检测实验表明，用双特异分子探针技术检测结果与显微镜检测结果基本一致，并且天然海水中其它浮游生物的存在对该检测无显著影响；藻细胞保存方式对信号值的影响实验表明，相同的细胞数值接进行现场检测时所得的信号值最高，其次是杂交后保存的样品，然后是裂解后保存的样品，信号值最低的是直接保存细胞；在整个生长周期中，对数生长期前期信号值逐渐升高，然后逐渐降低，结合细胞的生长率实验，发现当细胞的生长率高时，信号值也高，说明此期间细胞内的rRNA量也高。

目录

文摘

英文文摘

第一节文献综述

1.1海洋硅藻及其生态学意义

1.1.1海洋硅藻

1.1.2圆海链藻(Thalassiosira rotula)

1.2海洋浮游植物的检测方法

1.2.1形态学观察

1.2.2核酸探针技术

1.2.3免疫学技术

1.2.4实时荧光定量PCR

1.2.5 PCR-ELISA

1.2.6流式细胞术

1.2.7 HPLC技术

1.2.8生物传感器

1.2.9生物芯片

1.3核酸探针技术及其在浮游植物检测中的应用

1.3.1核酸探针技术

1.3.2核酸探针技术在浮游植物检测中的应用

1.4双特异分子探针技术及其在浮游植物检测中的应用

1.5基于核酸杂交技术的浮游植物检测仪器

第二节材料与方法

2.1材料

2.1.1试剂

2.1.2主要仪器

2.1.3实验材料及其来源

2.2.实验方法

2.2.1藻种培养与收获

2.2.2海藻总DNA及总RNA提取

2.2.4克隆与测序

2.2.5序列分析及探针设计

2.2.6双特异分子探针技术检测方法的建立

2.2.7靶物质验证实验

2.2.8特异性检测实验

2.2.9模拟样品的检测

2.2.10样品保存方式对检测信号的影响

2.2.11整个生长周期内检测信号的变化

第三节实验结果与分析

3.1 18S rRNA基因序列扩增及阳性克隆验证结果

3.2 18S rRNA基因测序结果

3.3序列比对与探针设计结果

3.4检测方法的建立

3.4.1抓捕探针最优浓度

3.4.2连接探针最优浓度

3.4.3探针标记方法的选择

3.4.4酶切温度对信号值及信号特异性的影响

3.4.5样品预处理方式的选择

3.5靶物质验证结果

3.6探针特异性实验

3.7建立标准曲线与模拟样品检测结果

3.7.1建立标准曲线

3.7.2模拟样品检测

3.8保存方式对检测信号的影响

3.9整个生长周期中检测信号的变化

第四节讨论

4.1双特异分子探针技术的优势

4.2双特异分子探针技术检测方法建立及验证过程中应考虑的问题

4.2.1靶序列的选择

4.2.2双特异分子探针的设计

4.2.3探针标记方法及信号检测方式的选择

4.2.4探针最优使用浓度的选择

4.2.5杂交条件的优化

4.2.6酶切条件的优化

4.2.7样品预处理方法对检测结果的影响

4.2.8靶物质的验证

4.3双特异分子探针技术应用于自然海区样品的检测

4.3.1定性检测

4.3.2标准曲线的建立及自然样品的检测

4.3.3样品保存方式对检测信号的影响

4.3.4细胞生长状态对检测信号的影响

结论

参考文献

致谢

论文发表情况