一种海洋的弧菌胞外多糖A101的抗生物膜作用研究

摘要

人们一直认为细菌是以单细胞形式存在,传统的抗菌药物研发也是以浮游细菌为靶点。然而近年来,研究发现自然界和宿主体内的细菌绝大多数以生物膜(biofilm)形式存在。生物膜是由细菌和其分泌的胞外基质在物体表面形成的高度组织化的多细胞结构,是细菌产生抗生素耐药和逃避机体免疫系统攻击的主要原因。细菌生物膜无处不在,在很多方面给人类生活带来严重的影响,如细菌的耐药性、生物腐蚀、食品污染等,已成为全球关注的重大科学难题。根据美国健康研究院的调查公告,80％以上的细菌性感染与生物膜有关。因此,细菌生物膜的防治已成为目前医药、材料等多领域研究与开发的前沿和热点。本论文旨在从海洋微生物中筛选能够抑制生物膜形成和/或破坏已形成的生物膜的活性物质,并探讨其结构特征、作用机制以及在生物膜防治方面的应用前景。以铜绿假单胞菌FRD1为试验菌株,用微量离心管生物膜体外模型筛选,发现一株来自海洋的弧菌QY101,其发酵液可以抑制FRD1的生物膜形成,并在一定浓度范围内具有量效关系。进一步试验表明,QY101发酵液中的活性成分与核酸、蛋白类物质无关,而与糖类物质有关。经过丙酮沉淀、透析、离子交换等方法分级纯化后,从QY101发酵液中得到了一种多糖,命名为A101。气相色谱分析结果表明,弧菌胞外多糖A101至少含有4种单糖残基,从光散射结果计算得出该多糖重均分子量约为1000 kD,红外光谱结果显示A101含有硫酸基,乙酰基,氨基等多种活性基团,其溶液有胶体性质并对波长为220nm的紫外光有强烈吸收。该多糖具有广谱的抗生物膜作用,对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌三种病原菌的20个菌株中的17株有显著生物膜形成抑制作用。为了更加直观和实时地观察A101对生物膜形成的抑制作用,建立了Flow-cell生物膜体外模型。利用该模型,发现A101对FRD1生物膜形成的抑制效果达到95%以上。此外,A101对已形成的FRD1生物膜也具有破坏作用,破坏效果达到85%。最低生物膜消除浓度MBEC试验结果表明, A101可以提高生物膜对抗生素的敏感性,使阿米卡星对生物膜细菌的杀灭作用提高16倍以上。A101并不抑制游离铜绿假单胞菌FRD1的生长,相反地能够促进其生长。唯一碳源实验结果表明A101不能作为碳源被FRD1利用。进一步研究发现,A101可以防止FRD1菌体簇集,使其分散生长,从而能够更好地利用环境营养。这种分散作用也正是A101抗生物膜作用的机制。结合相关研究报道,推测A101可能是封闭了FRD1细胞表面某些菌体赖以相互结合的位点,阻碍了菌体之间的相互作用,从而抑制了生物膜形成;而且,由于A101对菌体表面位点的结合力强于细菌间的结合力,故可以破坏已经形成的生物膜。本文发现了一种弧菌胞外多糖A101,该多糖不仅抑制生物膜的形成,还能破坏已经形成的生物膜;并且其作用具有广谱性,对多种细菌,尤其是临床常见的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的生物膜均有作用;A101可以增强抗生素对生物膜细菌的杀灭效果,具有这种作用的多糖在国际上尚属首次报道。A101有望开发成为高效、广谱、安全的抗生物膜制剂,不但在临床细菌生物膜相关慢性感染的治疗、抗细菌生物膜新材料的研发等方面具有重要的应用前景,而且在生物膜形成与放散、细菌细胞间的识别和相互作用等多个领域具有重要的研究价值。

目录

摘要

Abstract

前言

生物膜的形成

细菌生物膜感染的机制

生物膜去除研究

细菌生物膜研究技术

生物膜研究展望

第一章 海洋弧菌 QY101 胞外生物膜抑制物的发现

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 QY101 的发酵

1.3 褐藻胶裂合酶活力检测

1.4 铜绿假单胞菌FRD1 微管生物膜模型的构建

2 结果与讨论

2.1 FRD1 微管生物膜模型的构建

2.2 QY101 发酵液抑制铜绿假单胞菌生物膜形成

2.3 抑制物的性质分析

3 小结

第二章 多糖组分 A101 的初步分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 A101 的分离纯化

1.3 96 孔板生物膜模型的构建

1.4 元素分析

1.5 气相色谱

1.6 紫外光谱

1.7 红外光谱

1.8 凝胶渗透色谱

1.9 多角度激光光散射仪

1.10 丁达尔现象

2 结果与讨论

2.1 抑制作用的广谱性

2.2 元素分析

2.3 气相色谱

2.4 紫外光谱

2.5 红外光谱

2.6 凝胶渗透色谱

2.7 多角度激光光散射仪

2.8 丁达尔现象

3 小结

第三章 A101 对生物膜的破坏作用研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 FRD1－GFP 菌株的构建

1.3 Flow cell 实验

1.4 最低抑/杀菌浓度（MIC/MBC）

1.5 最低生物膜消除浓度（MBEC）

2 结果与讨论

2.1 FRD1－GFP 菌株的构建

2.2 Flow cell 模型的构建

2.3 A101 对生物膜生成的抑制作用

2.4 A101 对已形成的生物膜的破坏作用

2.5 A101 与抗生素联用杀灭生物膜细菌

3 小结

第四章 A101 作用机制初探

1 材料与方法

1.1 材料

2 结果与讨论

2.1 A101 对菌体生长有促进作用

2.2 A101 不能作为碳原被菌体利用

2.3 A101 有利于菌体的分散

2.4 A101 作用机制的推测

3 小结

总结与展望

参考文献

致谢

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