两株海洋亚历山大藻的分子鉴定以及Alexandrium catenella中细胞核增殖抗原基因的克隆和分析

摘要

亚历山大藻属(Alexandrium)是一类重要的海洋赤潮甲藻，广泛分布于北美、欧洲、亚洲等海域中，其中一半左右能够产生麻痹性神经贝毒。有毒亚历山大藻引发的赤潮造成的海水养殖业损失和人体中毒事件在国内外均有发生。因此，对亚历山大藻的生长，快速识别鉴定等研究也成为了研究热点。 亚历山大藻多为单细胞藻，形态学特征受环境变化及不同生理阶段的影响较大，一些种类仅个别甲板的形态上有极微小的差异，鉴定通常需要通过特殊的染色和甲壳解剖，使用电子显微镜鉴定。对于形态上特别相似的物种往往是难以定论(Taylor etal.，1985)。例如A. tamarense，A.catenella，A.fundyense等在分类上一直存在着争议和不确定性。 分子生物学方法的应用能提供更准确可靠的结果，其中应用最广泛的是利用核糖体5.8S rDNA和转录间隔区(intemal transcribed spacers，ITS)序列进行分类。ITS区是种间分类鉴定的可靠依据，同时ITS序列长度适宜，便于设计引物进行PCR反应扩增，已成为分子生物学进行藻类鉴定的普遍常用方法。 本文在对分离自中国青岛的2株海洋亚历山大藻(Alexandrium sp.qd2，Alexandrium sp.qd3)进行形态学描述的基础上，扩增获得了5.8S核糖体基因及其转录间隔区ITS1和ITS2，测序后进行了分子系统学分析。结果显示，A.sp.qd2和A.sp.qd3与来自韩国和日本的A.catenella最为接近，因此A.sp.qd2和A.sp.qd3应该归类到A.catenella，该种藻广泛分布于中国海域，而且具有不同的地理型。 由于赤潮都是由赤潮生物爆发性生长引起的，因此对与赤潮生物生长有关的功能基因研究有重要意义。细胞核增殖抗原(Proliferating Cell Nuclear.Antigen，PCNA)由Miyachi等于1978年在SLE(系统性红斑狼疮)患者的血清中首次发现并命名。研究发现PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。PCNA还参与了许多细胞重要事件，作为多种蛋白的功能转换因子发挥作用，因此对PCNA生物学功能的研究引起了研究者的极大兴趣。本实验克隆了A．catenella qdl和A．catenella qd2 PCNA基因部分cDNA序列，两段序列在41个碱基位点上有差别，但氨基酸没有差别。A．catenella qdl与同为甲藻属的Pyrocystis lunula和Pfiesteria piscicida的相似性为91％和89％，与绿藻门Dunaliella tertiolecta、真菌Aspergillus clavatus和硅藻门的Skeletonema costatum的相似值均在50％左右，与金藻门Pleurochrysis carterae和Isochrysis galbana的相似值为48％，与高等植物Arabidopsis thaliana和高等动物的相似值均在42％左右。由于PCNA基因在真核生物间是高度保守的，这也说明了甲藻介于真核生物和原核生物之间的特殊地位。因此，PCNA基因在甲藻中的特殊性更值得关注。 本文通过Southem杂交得到PCNA基因在A．catenella qdl中是单拷贝的。利用荧光定量PCR方法对PCNA基因的在各个生长时期内的表达进行研究，结果表明，PCNA基因在各个生长时期都有显著的差异，同时在指数期内PCAN基因的表达也有显著差异，基因在稳定期和指数期的表达与藻细胞生长呈正相关。

目录

文摘

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声明

第一章前言

1赤潮综述

1.1赤潮的定义及危害

1.2赤潮产生原因

1.3赤潮的防治与监测

2甲藻与赤潮

3亚历山大藻属的生物学研究进展

3.1亚历山大藻属与赤潮

3.2亚历山大藻属的分类研究进展

4细胞核内增殖抗原的研究进展

4.1 PCNA的功能结构

4.2 PCNA与DNA和蛋白质之间的相互作用

4.3 PCNA在各种细胞事件中的功能

4.4 PCNA在其他细胞事件中的作用

4.5 PCNA在藻类中的研究

4.6 PCNA研究展望

5课题目标和意义

第二章利用转录间隔区ITS和5.8SrDNA序列对两株海洋亚历山大藻进行的分子鉴定

1前言

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1 5.8S rDNA-ITS序列的扩增和分析

3.2系统树的构建和距离值的计算

4讨论

第三章链状亚历山大藻细胞核增殖抗原(PCNA)基因的克隆及表达研究

1前言

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1 PCNA基因部分序列的克隆与分析

3.2 Southern杂交结果

3.3荧光定量PCR条件的确定结果

3.4不同生长时期A.catenella.qdl PCNA基因表达量差异

4讨论

4.1 PCNA cDNA部分序列分析

4.2 Southern杂交结果

4.3利用荧光定量PCR对PCNA基因在不同生长时期表达量的研究

5小结及展望

参考文献

致谢