大菱鲆（Scophthalus maximus）鳍细胞系的建立

摘要

近年来，随着环境污染的日益加剧和养殖业的过度膨胀，大菱鲆的各种传染性疾病尤其是病毒病开始广泛传播，大菱鲆死亡率逐年上升，给大菱鲆养殖业带来了巨大的经济损失。查清病毒的感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗是从根本上解决和预防大菱鲆病毒病的关键，而建立大菱鲆细胞系又是研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗的有效方法。目前，国内外仅建立了少数几个大菱鲆细胞系，远远不能满足大菱鲆病毒学、病理学、毒理学、免疫学、遗传育种和种质保存等理论研究以及病毒疫苗研制等应用研究的需要，致使对当前迫切需要解决的大菱鲆病毒病及其病毒疫苗研制研究等进展缓慢，由于大菱鲆养殖业是我国北方地区海水养殖的一个支柱产业因此迫切需要建立大菱鲆细胞系。 为了建立大菱鲆鳍细胞系，本文以胰蛋白酶、透明质酸酶和Ⅱ型胶原酶消化法启动了大菱鲆鳍组织的原代培养，并在此基础上进一步优化培养液配方和培养条件。通过对比不同培养基中的大菱鲆鳍组织原代培养物，发现Leibovitz-15为大菱鲆鳍细胞的最适培养基；通过对比不同温度下的大菱鲆鳍组织原代培养物，发现20～24℃为大菱鲆鳍细胞的最适培养温度；通过对比不同pH值下的大菱鲆鳍组织原代培养物，发现pH 7.0～7.4为大菱鲆鳍细胞的最适生长pH值。为了成功启动大菱鲆鳍细胞的原代培养，本文还在培养液添加了羧甲基壳多糖、N-乙酰葡萄糖盐酸盐、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和胎牛血清。通过添加含羧甲基壳多糖(50μg/mL)，N-乙酰葡萄糖盐酸盐(50 μg/mL)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，10 ng/mL)，表皮生长因子(EGF，10 ng/mL)，发现在最适培养条件下，培养于含胎牛血清20％的L-15中的大菱鲆鳍组织块在原代培养启动培养4周后，便可以观察到明显的生长晕，迁出的细胞饱满，透光性好，为成纤维细胞样形态，生长分裂旺盛，并于组织块周围呈放射状排列，原代培养启动50天后可长成单层，成功启动了大菱鲆鳍细胞的原代培养。 对长成单层的大菱鲆鳍细胞，以胰蛋白酶消化法进行传代，研究显示，培养于含羧甲基壳多糖(50μg/mL)，N-乙酰葡萄糖盐酸盐(50μg/mL)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，10 ng/mL)，表皮生长因子(EGF，10 ng/mL)的L-15培养液(2096胎牛血清)中的的大菱鲆鳍细胞为典型的成纤维细胞样，生长与分裂状况良好，以1/2进行传代，4-5天可长成单层，经液氮冻存和复苏后仍保持有原有形态和较高存活率，目前已传至80代以上，成功建立了大菱鲆鳍细胞的连续性细胞系。通过对60代大菱鲆鳍细胞生长特性研究发现，该细胞系细胞在贴壁生长的前1.5天处于迟缓期，第2.5天至3.5天处于对数生长期，第4.5天则基本处于平稳期，之后细胞开始衰退，细胞的群体倍增时间为62.4 h。为了鉴定大菱鲆鳍细胞系的性质，对其进行了染色体分析，结果显示，第60代大菱鲆鳍细胞出现了染色体的非整倍性，其染色体数目分布在28-60之间，其中44条的细胞占总细胞的75.1％，说明该细胞系的特征性染色体为44条，证实本文所建立的大菱鲆鳍细胞系为大菱鲆细胞系。 本文所建立的大菱鲆鳍细胞系，是查清病毒对大菱鲆细胞的感染途径与感染机理等的理想的体外研究体系，为从根本上解决大菱鲆病毒病奠定了基础；同时，该细胞系又可作为大菱鲆病毒的体外繁殖体系，对于病毒疫苗研制和大菱鲆病毒病的预防治疗不仅具有重要的理论意义还具有重要的应用价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

0前言

0.1鱼类细胞培养的研究历程

0.2鱼类细胞系的应用

0.2.1鱼类细胞系在毒理学中的应用

0.2.2鱼类细胞系在鱼类遗传学中的应用

0.2.3鱼类细胞系在活性物质制备中的应用

0.2.4鱼类细胞系在鱼类生理学中的应用

0.2.5鱼类细胞系在鱼类免疫学中的应用

0.2.6鱼类细胞系在鱼类资源保护中的应用

0.2.7鱼类细胞系在鱼类病毒病研究中的应用

0.3鱼类细胞系建立的方法

0.3.1鱼类细胞培养的组织来源

0.3.2鱼类细胞培养中常用的消毒方法

0.3.3鱼类细胞原代培养常用的方法

0.3.4鱼类细胞培养常用的培养基和添加物

0.3.5鱼类细胞培养的最适条件

1大菱鲆鳍细胞原代培养的启动及培养条件的优化

1.1材料与用品

1.1.1实验材料

1.1.2实验仪器

1.1.3实验药品

1.1.4常用溶液配方

1.2方法

1.2.1大菱鲆鳍细胞原代培养的方法

1.2.2大菱鲆鳍细胞最适培养基的确定

1.2.3大菱鲆鳍细胞最适培养条件的确定

1.2.4大菱鲆鳍细胞原代培养的启动

1.3结果

1.3.1大菱鲆鳍细胞最适培养基的确定

1.3.2大菱鲆鳍细胞最适培养条件的确定

1.3.3大菱鲆鳍细胞原代培养的启动

1.4讨论

结论

2大菱鲆鳍细胞系的建立

2.1材料与用品

2.1.1实验仪器

2.1.2实验药品

2.1.3常用溶液配方

2.2方法

2.2.1大菱鲆鳍细胞传代培养

2.2.2大菱鲆鳍细胞的冻存与复苏

2.2.3大菱鲆鳍细胞系的生长特性测定

2.2.4大菱鲆鳍细胞系的染色体分析

2.3结果

2.3.1传代培养的大菱鲆鳍细胞

2.3.2复苏的大菱鲆鳍细胞

2.3.3大菱鲆鳍细胞系的生长特性

2.3.4大菱鲆鳍细胞系的染色体分析

2.4讨论

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的文章

致谢