大泷六线鱼繁殖内分泌生理功能及GH基因部分序列的克隆

摘要

大泷六线鱼属于纳形目鱼类，在我国主要产自黄海和渤海沿岸。本论文以青岛近海水域性成熟的野生大泷六线鱼(Hexagrammos otakii Jordan and Starks)为研究对象，运用组织学、免疫组织化学和性激素放射免疫测定方法，对大泷六线鱼的性腺和血浆性类固醇激素进行了深入的研究和分析，并采用分子生物学的方法对大泷六线鱼生长激素(GH)的部分序列进行了克隆研究。所得结果与结论如下： 1.大泷六线鱼性腺发育的组织学观察 大泷六线鱼精巢一对，非繁殖期的精巢为线条状或扁带形，淡黄色，繁殖期精巢则肥大呈睾丸状，白色至乳白色。组织学观察大泷六线鱼精巢为典型的小叶型结构，精小叶间有间质细胞(Leydigs cell)，小叶内有支持细胞(Sertolis cell)及精小囊结构，其精巢的周年发育历程可分为：重复发育Ⅲ期，精子形成Ⅳ期，精子成熟Ⅴ期和退化吸收Ⅵ期。8月下旬生精活动启动，生殖季节为11月至翌年1月份，2～4月份为退化吸收期，5～7月份为重复发育Ⅲ期。 大泷六线鱼卵巢和精巢一样，成对，非繁殖期的卵巢淡黄色或淡红色，繁殖期卵巢则饱满呈长囊状，青灰色。组织学观察，卵巢的周年发育分为5个时期：重复发育Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期和退化吸收Ⅵ期。卵细胞发育分为5个时相，Ⅱ时相卵母细胞胞质被苏木精染成深蓝色，Ⅲ时相卵母细胞卵黄开始积累；Ⅳ时相卵母细胞放射膜明显；Ⅳ时相后期核开始偏位，胚基出现；Ⅴ时相成熟卵细胞胞核消失，呈游离状态；Ⅵ期卵巢内卵黄颗粒融合成块状，并开始退化吸收。各个时期的卵细胞核仁数量，胞膜厚度及细胞体积变化很大。 2.大泷六线鱼血浆性激素T和E2的季节变化研究 按季节分四次采集野生大泷六线鱼血液，采用Ⅰ<'125>标记的放射免疫测定方法检测雄鱼和雌鱼的睾酮(T)和雌二醇(E2)的水平。研究发现大泷六线鱼血浆性激素在年周期中的变化规律为：在繁殖期，即从11月份到来年的1月份，大泷六线鱼体内的雌二醇及睾酮含量增长迅速，呈显著性变化(P<0.05)：雄鱼血浆睾酮含量均值为21.2625ng/dl，血浆雌二醇E<,2>含量均值为16.5908pg/ml；雌鱼血浆雌二醇E<,2>含量均值为13.36083pg/ml，血浆睾酮含量均值为39.381ng/d1，均达到最高峰值。在非繁殖期即2～8月份血浆性激素水平下降迅速，呈显著性变化(P<0.05)，其中雌性大泷六线鱼血浆中T含量在5～7月份已经检测不到。在繁殖前期即8～10月份性激素含量均开始缓慢增高。 3.大泷六线鱼性腺免疫组织化学观察 在卵巢发育的早期卵母细胞的胞质对雌激素受体(ER)、雄激素受体(AR)抗体显示强的免疫阳性反应，在Ⅲ时相卵母细胞胞质对ER、AR抗体的免疫阳性明显减弱，在Ⅳ时相卵母细胞中胞质对ER、AR抗体呈现免疫阴性反应，核质对ER抗体呈现弱的免疫阳性反应、滤泡细胞对ER、AR抗体均呈现弱的阳性反应。在早期卵母细胞胞质、核质、核仁对芳香化酶抗体均成强阳性反应，进入大生长期免疫阳性明显减弱，在Ⅳ时相卵母细胞中，仅核质和滤泡膜呈弱的免疫阳性反应。 在雄性，在精巢发育的各个时期，ER抗体主要定位在精巢的间质细胞和精小囊壁，呈强的免疫阳性反应。AR抗体仅定位在精巢的间质细胞处，但免疫阳性反应比ER抗体要弱。芳香化酶抗体在重复发育Ⅲ期中呈强的免疫阳性反应，尤其是精原细胞、初级精母细胞的细胞核。随着精巢的发育，免疫阳性反应逐渐减弱，次级精母细胞仅胞核呈弱的阳性反应，其余精子细胞、精子均成阴性反应。这些研究结果为证明性类固醇激素和芳香化酶参与调节性腺发育成熟和生殖内分泌调控轴的功能提供了新的形态学依据。 4.大泷六线鱼生长激素(GH)基因部分序列的克隆 根据比较基因组学的原理，运用Oligo 6.0软件设计一对引物，在基因组DNA上成功克隆了长915bp的内含子片段。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词表

声明

前言

第一章文献综述

第二章大泷六线鱼性腺发育的周年变化研究

1材料和方法

2结果

2.1精巢的发育分期和周年变化

2.2卵巢的发育分期和卵细胞的变化

3讨论

3.1产卵和排精方式

3.2大泷六线鱼精巢类型和精巢中非生殖细胞

3.3两种卵黄颗粒

3.4雌性大泷六线鱼HIS的季节变化

4 小结

第三章大泷六线鱼血浆性类固醇激素水平的周年变化研究

1材料和方法

2放射免疫测定(RIA)方法的建立

3结果

3.1雄性大泷六线鱼血浆E2和T含量水平的季节变化

3.2雌性大泷六线鱼血浆E2和T含量水平的季节变化

4讨论

4.1性成熟野生大泷六线鱼雄鱼血浆T和E2的变化

4.2性成熟野生大泷六线鱼雌鱼血浆E2和T的变化

5小结

第四章大泷六线鱼性腺ER和AR的免疫组织化学研究

1材料和方法

2结果

2.1性腺及性细胞中雌激素受体(ER)的免疫组织化学

2.2性腺及性细胞中雄激素受体(AR)的免疫组织化学

3讨论

4小结

第五章大泷六线鱼性腺芳香化酶的免疫组织化学研究

1材料与方法

2结果

2.1芳香化酶在精巢及精细胞中的免疫组织化学定位

2.2芳香化酶在卵巢及初级卵母细胞中的免疫组织化学定位

3讨论

3.1芳香化酶与精巢发育的关系

3.2芳香化酶与卵巢发育的关系

4小结

第六章大泷六线鱼生长激素(GH)部分序列克隆的研究

1实验材料

2实验方法

3结果与分析

3.1基因组DNA提取结果

3.2六线鱼GH部分片段PCR扩增

3.3 PCR产物回收

3.4 pGEM-T载体连接的片段的鉴定

3.5测序结果

4讨论

4.1模板的抽提及浓度

4.2大泷六线鱼GH基因部分片段的克隆

参考文献

致谢