中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）两个DEAD-box家族基因Fc-vasa和Fc-PL10a的克隆和表达分析

摘要

DEAD-box家族蛋白是一类ATP依赖的RNA解旋酶，广泛存在于从细菌到哺乳动物的许多物种中，参与RNA代谢的几乎所有过程。其中的vasa和PL10基因对于生殖细胞的发生具有重要作用。由于vasa基因在许多动物生殖系细胞中的表达特异性，它被广泛用作生殖细胞的分子标记物，在动物生殖细胞发生和生殖调控等研究中起到了重要的作用。中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)是我国最重要的经济虾类之一，对其生殖和发育的研究具有重要意义。本文采用同源克隆策略，筛选和克隆了中国明对虾两个DEAD-box家族基因Fc-vasa和Fc-PL10a的全长cDNA序列，并对其进行了序列特征和表达分析。 克隆得到的Fc-vasa基因cDNA序列全长2893 bp，含有开放阅读框2139 bp，可以编码712个氨基酸，Fc-PL10a基因cDNA序列全长2398 bp，其中开放阅读框长1983 bp，编码660个氨基酸。两基因推导的氨基酸序列具有DEAD-box家族蛋白共有的全部九个保守结构域和RGG重复序列，Fc-VASA、Fc-PL10A具有VASA和PL10蛋白共同保守的ARKF框，Fc-VASA的N端区域存在3个VASA蛋白特有的锌指结构(CCHC框)。同源性比对和进化分析显示两基因编码蛋白分别与其他物种的VASA和PL10相关蛋白具有较高的相似性，证明VASA和PL10蛋白在进化上高度保守。蛋白三维结构预测蛋白功能显示两个蛋白Fc-VASA和Fc-PL10A具备了DEAD-box家族蛋白RNA连接，ATP酶和解旋酶的功能。 半定量RT-PCR分析显示，Fc-vasa基因在成体性腺组织中特异表达，表达量随着性腺成熟逐渐降低；原位杂交结果表明Fc-vasa mRNA主要在精原细胞和卵母细胞的胞质中表达显著，因此，推测该基因可能参与中国明对虾两性配子的发生。胚胎和幼虫RT-PCR分析检测到2细胞期至膜内无节幼的各期胚胎都含有 Fc-vasa mRNA。但表达量逐渐降低，自出膜后的无节幼体开始检测不到表达信号，根据以上结果推测，Fc-vasa mRNA可能作为母源生殖质成分参与中国明对虾生殖细胞的决定和形成。另外，RT-PCR分析检测到Fc-PL10a在性腺和其它成体组织中都有表达，推测该基因可能具有更广泛的功能。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1DEAD-box家族基因

1.1DEAD-box家族基因的功能

1.2 vasa基因

1.3 PL10基因

2原生殖细胞

2.1原生殖细胞的形成

2.2原生殖细胞特化的分子机制

2.3原生殖细胞的鉴定

2.4节肢类原生殖细胞的研究进展

3中国明对虾生殖和发育相关研究

3.1中国明对虾基础生物学特性

3.2中国明对虾生殖和发育相关研究概况

4本研究立题的必要性

第二章中国明对虾两个DEAD-box基因Fc-vasa和Fc-PL10a的克隆和特征分析

1材料

2方法

2.1总RNA提取和纯化

2.2第一链cDNA合成

2.3简并PCR扩增目的片断

2.4 RACE-PCR技术获得两基因全长cDNA序列

2.5序列及系统进化分析

2.6蛋白质三维结构预测

3结果

3.1总RNA的提取

3.2 DEAD-box家族基因全长cDNA的克隆策略

3.3 Fc-vasa和Fc-PL10a基因的核苷酸序列特征

3.4 Fc-vasa和Fc-PL10a基因的氨基酸序列特征

3.5序列比对和系统进化分析

3.6 Fc-VASA和Fc-PL10A蛋白三维构象特征

4 讨论

第三章中国明对虾Fc-vasa和Fc-PL10a基因的表达分析

1材料

2方法

2.1 RT-PCR方法

2.2原位杂交方法

3结果

3.1 Fc-vasa基因在成体组织中的RT-PCR表达分析

3.2 Fc-vasa基因在不同发育时期性腺中的RT-PCR表达分析

3.3 Fc-vasa基因在性腺中的定位

3.4 Fc-vasa基因在胚胎发育中的RT-PCR表达分析

3.5 Fc-PL10a基因在成体组织中的RT-PCR表达分析

4讨论

4.1 Fc-vasa基因在生殖细胞系中特异性表达

4.2 Fc-vasa基因可能参与配子发生过程

4.3 Fc-vasa基因可能参与胚胎发生中原生殖细胞的形成和分化

4.4 Fc-PL10a基因在成体组织中广泛表达

总结

参考文献

致谢