长江口沉积物反硝化细菌和南冲绳海槽深海沉积物产胞外酶细菌多样性研究

摘要

长江口是世界第三大河口，在全球海洋氮循环中扮演着重要的角色。本论文采用以PCR技术为基础的构建基因文库的方法对长江口沉积物反硝化细菌的nirS基因的多样性进行了研究。七个站位共筛选了633个克隆，扩增的nirS基因限制性酶切分析结果表明633个克隆分别属于364个不同的操作分类单元(Operational Taxonomic Unit，OTU)。各个站位OTU个数为59～75不等，站位之间OTU的重叠率为21.7～57.4％，所有的OTU都进行了基因测序。nirS基因序列与NCBI数据库中nirS基因序列的相似度在61～100％。分子系统学分析表明，包括波罗的海、墨西哥湾等12大海域和河口的沉积物或水体的nitS基因序列可划分为7个Marine Clusters(Marine Cluster Ⅰ-Ⅶ)，其中Marine ClusterⅦ在序列50％相似的水平上又可划分为8个亚簇，Marine Cluster VⅡg和Marine Cluster Ⅶh是本项研究中新发现的两个亚簇，体现了长江口、东海沉积环境与其他海域相比反硝化细菌多样性的特点。基于OTU百分率和nirS基因序列的Cluster Environmem、Jackknife Cluster和主座标分析(Principal Coordinates Analysis，PCA)分析发现相距比较近的站位反硝化细菌群落较相距远的站位更相似。因此地理位置是反硝化细菌群落结构的重要影响因子。 南冲绳海槽是东海大陆架和台湾岛颗粒有机物的主要沉积区。采用培养的方法对南冲绳海槽MD05-2907站位深海沉积物中产胞外酶细菌多样性进行研究。对分离到的98株菌的16S rRNA基因的系统进化分析表明，这98株菌分别属于4个不同门的14个属，包括变形菌门(Proteobacteria)，厚壁菌门(Firmicutes)(低G+C革兰氏阳性菌)，放线菌门(Actinobacteria)(高G+C革兰氏阳性菌)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)的种特别是盐单胞菌属(Halomonas)和嗜冷杆菌属(Psychrobacter)的种是优势种。产胞外酶实验表明，大多数细菌种能产生至少一种胞外酶，例如淀粉酶、蛋白酶、脂酶、核酸酶，没有筛选到产几丁质酶的细菌。而且有相当一部分细菌种能产生低温酶。产胞外酶菌株多数集中在γ-变形菌纲、厚壁菌门(低G+C革兰氏阳性菌)和拟杆菌门。其中盐单胞菌属的某些菌株能在两种温度下产生所有测试种类的胞外酶(几丁质酶除外)，嗜冷杆菌属的种在所有测试胞外酶(几丁质酶除外)和28℃和/或4℃筛选实验中都能检测到。本研究中还分离培养到一个新属和新种的纯培养Wangia profunda gen.nov.,sp.nov.。对邻近西太平洋海域南冲绳海槽深海沉积物产胞外酶细菌多样性的研究对了解深海环境特点、开发和利用深海微生物资源、开发新的生物催化剂特别是低温酶提供了重要的理论依据和基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第一节氮循环概述

1氮循环简介

2反硝化细菌

3氮污染

4反硝化细菌多样性研究现状

第二节深海微生物的研究进展及应用

1深海微生物的研究进展

2南冲绳海槽环境特点

3深海微生物的研究方法

第三节本研究的目的和拟解决的科学问题

第二章长江口沉积物反硝化细菌多样性研究

1实验材料及仪器设备

1.1样品采集

1.2环境因子的测定

1.3主要仪器

1.4主要培养基

2实验方法

2.1 nirS基因文库建立

2.2基因文库克隆及序列测定

2.3 nirS基因序列的统计学及系统进化分析

3实验结果

3.1样品环境因子

3.2扩增的nirs基因的限制性酶切分析

3.3覆盖率和稀释曲线分析

3.4聚类分析

3.5多样性指数分析

3.6反硝化细菌nirS基因序列及系统进化分析

4讨论

4.1基因文库方法研究细菌多样性的优缺点

4.2反硝化细菌群落结构与环境的关系

5小结

第三章南冲绳海槽深海沉积物产胞外酶细菌多样性研究

1实验材料及仪器设备

1.1实验材料

1.2主要仪器

1.3基本培养基和试剂

2实验方法

2.1可培养细菌的培养和分离

2.2 16S rRNA基因扩增和系统进化分析

2.3产胞外水解酶的分离筛选

3结果

3.1分离培养菌株的形态及命名

3.2分离培养细菌的系统进化分析

3.3一个新属和新种的发现和鉴定

3.4产胞外水解酶的分离筛选

4讨论

5小结

参考文献

附表

致谢

个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果