抗营养因子对牙鲆(Paralichthys olivaceus)利用大豆蛋白源的影响

摘要

本文选择我国典型的肉食性鱼类牙鲆(Paralichthys olivaceus)为研究对象，采用传统养殖实验、体外细胞培养和胃内灌喂三种不同的实验模式比较研究影响牙鲆利用大豆蛋白的因素，阐明水生动物不能有效利用植物性蛋白源的原因。研究内容包括：(1)大豆皂甙对牙鲆摄食、生长和组织学的影响；(2)大豆异黄酮对牙鲆摄食、生长和组织学的影响；(3)三种大豆抗营养因子对牙鲆肠上皮细胞形态、存活率、增殖、膜完整性和功能的影响；(4)等摄食条件下用豆粕替代鱼粉对牙鲆生长、饲料效率和表观消化率的影响。主要研究结果如下： (1)以鱼粉为主要蛋白源，鱼油为脂肪源，小麦粉为糖源，以三氧化二钇为外源性指示剂，制成4种等氮、等能(粗蛋白49.1％，总能20.1 KJ/g)的实验饲料，使饲料中大豆皂甙实际含量分别达到0(对照组)、0.08％、0.32％和0.64％，研究不同大豆皂甙含量对牙鲆(2.58±0.01 g)摄食、生长、饲料效率、表观消化率和组织学的影响。实验在室内循环海水养殖系统中进行，每个处理设置三个重复，每天投喂2次，达饱食水平。分别在养殖实验开始、28 d和结束时对牙鲆进行称重。实验结果表明，随着饲料中大豆皂甙水平的升高，牙鲆摄食率、平均体重、鱼体粗脂肪含量和饲料粗蛋白表观消化率均显著下降(P＜0.05)。在实验前28 d，随着饲料中大豆皂甙含量的提高，牙鲆的摄食率呈线性下降趋势(r=-0.869，P＜0.001)，但试验结束时各组间摄食率相比较差异不显著(P＞0.05)。与对照组相比较，无论在28 d还是试验结束时，饲料中添加0.64％大豆皂甙都显著降低了牙鲆的平均体重(P＜0.001)。添加0.32％的大豆皂甙在28 d时的平均体重显著低于对照组(P＜0.05)，但是试验结束时平均体重与对照组没有显著差异(P＞0.05)。高浓度的大豆皂甙(0.64％)还造成了牙鲆肝脏和后肠组织的病理性变化。通过分析认为，高含量的大豆皂甙显著抑制了牙鲆的摄食和生长性能，因此在以大豆制品来替代鱼粉饲喂牙鲆时不应该忽略大豆皂甙的抗营养作用。 (2)以鱼粉为主要蛋白源，鱼油为脂肪源，小麦粉为糖源，以三氧化二钇为外源性指示剂，制成4种等氮、等能(粗蛋白49.1％，总能20.1 KJ/g)实验饲料，使饲料中大豆异黄酮实际含量分别达到0(对照组)、0.1％、0.4％和0.8％，研究不同大豆异黄酮含量对牙鲆(2.58±0.01 g)摄食、生长、饲料效率、表观消化率和组织学的影响。实验在室内循环海水养殖系统中进行，每个处理设置三个重复，每天投喂2次，达饱食水平。实验结果表明，在饲料中添加0.1％和0.4％的大豆异黄酮对牙鲆摄食、生长、饲料效率、鱼体组成、表观消化率和组织学结构均没有显著影响(P＞0.05)。而与对照组相比较，饲料中添加0.8％大豆异黄酮显著降低了牙鲆的平均体重、鱼体的粗脂肪含量和饲料表观消化率(P＜0.05)，并造成了牙鲆后肠组织的病理性变化。通过分析认为，如果饲料中大豆异黄酮的含量不超过0.4％，它对牙鲆的抗营养作用不明显。由于一般大豆制品中大豆异黄酮的含量在0.1～0.3％，因此本文建议在使用大豆制品来替代鱼粉饲喂牙鲆时可以不用考虑大豆异黄酮的抗营养作用。 (3)通过分离和原代培养牙鲆肠道上皮细胞，并以其为细胞模型，研究大豆中三种热稳定性抗营养因子对其形态、存活率、增殖、膜完整性和功能的影响。本实验研究的三种抗营养因子为大豆皂甙、植酸和棉子糖，其在培养液中的浓度分别为2、4和8 g L-1。结果表明：与其他三个处理组相比(对照、植酸和棉子糖)，在培养液中添加2 g L-1的大豆皂甙显著抑制牙鲆肠道上皮细胞的存活、增殖和细胞碱性磷酸酶活力(P＜0.001)，并严重破坏了牙鲆肠上皮细胞细胞膜的完整性，改变了细胞的形态结构；与对照组相比，在培养液中添加4 g L-1的植酸显著改变牙鲆肠上皮细胞的形态结构，并抑制细胞的存活、增殖、细胞膜完整性和细胞碱性磷酸酶活力(P＜0.05)；与对照组相比，在培养液中添加8 g L-1的棉子糖对牙鲆肠道上皮细胞的形态结构、存活、增殖、细胞膜完整性和细胞碱性磷酸酶活力均没有显著影响(P＞0.05)。本实验添加的浓度参考了这三种抗营养因子在一般大豆制品中的含量，也是当牙鲆摄食含有50％豆粕的饲料后它的肠上皮细胞所在环境的抗营养因子含量，比其他以细胞为研究模型的报道要高。通过分析认为，在使用大豆制品来替代鱼粉饲喂牙鲆时应重视大豆皂甙和植酸对鱼类肠道的损害作用，并设法去除，不过可以不用考虑棉子糖的抗营养作用。 (4)以鱼粉和豆粕为蛋白源，配制了4种等氮等能的实验饲料(粗蛋白50.0％，总能20.5 KJ/g)。采用长时间胃内灌喂法(被动摄食)投喂牙鲆(60.0±0.66 g)，在摄食量相同的情况下，研究以鱼粉为蛋白源的饲料中添加多种抗营养因子(0.2％大豆胰蛋白酶抑制因子、0.2％大豆皂甙、0.2％大豆异黄酮、0.4％植酸钠和0.5％棉子糖)和以45％豆粕替代鱼粉为蛋白源的饲料中添加晶体氨基酸(0.75％蛋氨酸和0.25％赖氨酸)对牙鲆生长、存活、饲料效率和表观消化率的影响。实验在室内循环海水养殖系统中进行，每桶5尾鱼，每个处理设置三个重复，每天人工灌喂饲料1次，每尾鱼1ml(干重0.54 g)。研究结果表明：采用灌喂法养殖的牙鲆生长和存活状况良好，对照组饲料效率达到1.22，且实验期间没有出现鱼体死亡现象；在摄食量相同的情况下，用豆粕替代45％的鱼粉显著降低了牙鲆的体增重、饲料效率和表观消化率(P＜0.05)，且平均体增重还不到鱼粉组的一半(从15.68g到7.73g，P＜0.05)；在摄食量相同的情况下，饲料中添加多种抗营养因子在实验开始的前四天显著降低了牙鲆的体增重和饲料效率(P＜0.05)，但随着实验周期的延长，在饲料中添加多种抗营养因子对牙鲆的体增重、饲料效率和表观消化率均没有显著影响(P＞0.05)；在摄食量相同的情况下，与豆粕组相比较，在豆粕饲料中添加蛋氨酸和赖氨酸对牙鲆的体增重、饲料效率和表观消化率均没有显著影响(P＞0.05)。通过分析认为，在用豆粕替代45％鱼粉的实验中，抗营养因子不是导致牙鲆生长下降的主要因素；在替代45％鱼粉的豆粕饲料中添加蛋氨酸和赖氨酸并不能有效改变豆粕的替代效果；由于本实验采用的是人工灌喂的投喂模式，不会存在诱食性差的因素。因此本文认为可能还存在影响牙鲆利用大豆蛋白源的其他因素，并提出了以下三个易被忽略的因素：①豆粕中存在大量不能被鱼类利用的能量物质；②大豆蛋白本身的抗营养作用；③大豆蛋白和鱼粉蛋白水解生成的小肽混合物组成不同。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章 综述：限制鱼类利用植物蛋白源的因素

1寻求鱼粉替代蛋白源的必要性

2水产饲料中鱼粉替代研究概况及存在的问题

3水产动物对植物蛋白源利用率低的原因

3.1豆粕中氨基酸组成的不平衡

3.2适口性的影响

3.3豆粕中部分营养物质的相对缺乏或过量

3.4豆粕中含有大量的抗营养因子

4研究目的和意义

4.1研究目的

4.2理论意义与实际应用价值

5研究内容

5.1主要研究内容及拟解决的关键问题

5.2拟采取的研究方法、技术路线和实施方案

第二章 大豆皂甙对牙鲆摄食、生长和组织学的影响

1前言

2材料和方法

2.1实验饲料及大豆皂甙添加量的设计

2.2实验动物及饲养管理

2.3样品收集及化学分析

2.4计算及统计方法

3实验结果

3.1饲料中添加大豆皂甙对牙鲆摄食、生长和成活率的影响

3.2饲料中添加大豆皂甙对牙鲆鱼体生化组成的影响

3.3饲料中添加大豆皂甙对牙鲆表观消化率的影响

3.4饲料中添加大豆皂甙对牙鲆肠和血浆LDH和ALP活性的影响

3.5饲料中添加大豆皂甙对牙鲆肝脏和后肠组织学的影响

4讨论

4.1饲料中添加高浓度大豆皂甙（0.64%）对牙鲆的影响

4.2低浓度大豆皂甙(0.08％添加量)对牙鲆的影响

4.3饲料中添加中等浓度大豆皂甙(0.32％)对牙鲆的影响

5结论

附表及附图

第三章 大豆异黄酮对牙鲆摄食、生长和组织学的影响

1前言

2材料和方法

2.1实验饲料及大豆异黄酮添加量的设计

2.2实验动物及饲养管理

2.3样品收集及化学分析

2.4计算及统计方法

3实验结果

3.1饲料中添加大豆异黄酮对牙鲆摄食、生长和成活率的影响

3.2饲料中添加大豆异黄酮对牙鲆鱼体生化组成的影响

3.3饲料中添加大豆异黄酮对牙鲆表观消化率的影响

3.4饲料中添加大豆异黄酮对牙鲆肝脏和后肠组织学的影响

4讨论

4.1大豆异黄酮对牙鲆摄食和生长性能的影响

4.2饲料中添加大豆异黄酮对机体影响研究的争议

5结论

附表及附图

第四章 三种大豆抗营养因子对牙鲆肠上皮细胞形态、存活率、增殖、膜完整性和功能的影响

1前言

2材料和方法

2.1牙鲆

2.2药品、试剂及配制

2.3仪器设备

2.4牙鲆肠道上皮细胞的分离和培养

2.5抗营养因子对牙鲆肠道上皮细胞形态的影响

2.6抗营养因子对牙鲆肠道上皮细胞存活率的影响

2.7抗营养因子对牙鲆肠道上皮细胞增殖的影响

2.8抗营养因子对牙鲆肠道上皮细胞细胞膜完整性的影响

2.9抗营养因子对牙鲆肠上皮细胞碱性磷酸酶（AKP）活性的影响

2.10计算及统计方法

3实验结果

3.1抗营养因子对牙鲆肠道上皮细胞形态的影响

3.2抗营养因子对牙鲆肠道上皮细胞存活率的影响

3.3抗营养因子对牙鲆肠道上皮细胞增殖的影响

3.4抗营养因子对牙鲆肠道上皮细胞细胞膜完整性的影响

3.5抗营养因子对牙鲆肠道上皮细胞碱性磷酸酶活力的影响

4讨论

4.1牙鲆肠道上皮细胞的分离和培养

4.2大豆皂甙对牙鲆肠道上皮细胞的影响

4.3植酸对牙鲆肠道上皮细胞的影响

4.4棉子糖对牙鲆肠道上皮细胞的影响

5结论

附表及附图

第五章 等摄食量的条件下用豆粕替代鱼粉对牙鲆生长、饲料效率和表观消化率的影响

1前言

2材料和方法

2.1实验饲料及投喂方法

2.2实验动物及饲养管理

2.3样品收集及化学分析

2.4计算及统计方法

3实验结果

3.1不同处理的饲料对牙鲆生长性能的影响

3.2不同处理的饲料对牙鲆表观消化率的影响

4讨论

4.1采用灌喂方法做牙鲆养殖试验的可行性

4.2用豆粕替代45％的鱼粉对牙鲆的影响

4.3在基础饲料中添加多种抗营养因子对牙鲆的影响

4.4用豆粕替代鱼粉的饲料中添加氨基酸对牙鲆的影响

4.5影响牙鲆利用豆粕因素的探讨

5结论

附表及附图

参考文献(Reference List)

致谢