特殊环境微生物的次生代谢产物研究

摘要

本论文采用活性追踪的方法开展了特殊环境的微生物的抗肿瘤活性代谢产物的研究工作。内容包括：“天才菌株”的筛选和发酵条件考察；抗肿瘤活性成分的追踪分离；单体化合物的结构解析；单体化合物抗肿瘤活性的初步评价。 采用TLC和HPLC相结合的化学筛选方法，对43株活性红树林真菌和20株高盐真菌代谢产物的化学多样性进行了研究，从中选出6株真菌作为本论文的研究对象。 通过改变培养基、盐浓度等方法，研究了1株高产细胞松弛素类化合物的“天才菌”KLA03不同盐浓度下的次生代谢产物的差异。 采用海虾生物致死法和tsFT210细胞的流式细胞术筛选模型，以细胞周期抑制和细胞凋亡诱导以及坏死性细胞毒为活性指标，对48株海洋微藻进行了活性筛选，从中选出1株高活性的微藻作为本论文的研究对象。 在获得了目标菌株并考察了其培养条件后，对6株目标真菌(含3株TalentedStrains)和1株微藻进行了大量发酵。对发酵产物运用萃取、薄层层析、(正相、反相)硅胶柱层析、L，H-20凝胶柱层析、反相高压液相等分离纯化手段，从焦曲霉(Aspergillus ustus094102)的代谢产物中分离得到42个化合物单体(1-42)；从扩张青霉(Penicillium expansum091006)中分离得到了16个单体化合物(43-58)；从黄曲霉(Aspergillus flavus092008)中分离得到8个单体化合物(59-66)；从耐盐真菌柑桔青霉(Penicillium citrinum B-57)中分离得到了15个单体化合物(67-81)；从耐盐真菌青霉(Penicillium sp．B-58)中分离得到了16个单体化合物(82-97)，从真菌KLA03曲丽穗霉(Spicaria elegans)中分离得到了7个单体化合物(98-104)，从金藻(Ruttnera spectabilis H55)中分离得到了2个单体化合物(105-106)。 继而，利用理化性质和波谱学方法(IR，UV，MS，NMR，CD)结合化学反应阐明了这106个化合物的化学结构，其中新化合物42个，包括：10个补身烷型倍半萜类化合物(1-11)、8个苯并呋喃类化合物(14-21)、6个蛇孢假壳素类二倍半萜烯类化合物(24-29)、6个简单苯的衍生物(34-39)、6个结构新颖的甲苯酚三聚体(43-48)、2个没药烷型倍半萜类化合物(49-50)、1个黄曲霉毒素类化合物(59)、2个结构新颖的二聚橘霉素类化合物(67-68)和1个不对称的二聚对羟基苯丙烯酸化合物(98)。已知化合物的结构类型还涉及二氧哌嗪类化合物(41，54-55，64，82-87)，吡喃类化合物(65，88-91)，蒽醌类化合物(63，79-81)，橘霉素及其衍生物(73-78)，甾体类化合物(40，57-58)，三萜类化合物(56)，tetiamic acid类化合物(72)和aspochalasin类化合物(101)，类胡萝卜素类化合物(105)和脂肪族类化合物(106)。 利用MTT法、SRB法以及流式细胞术结合形态学检测的方法，在细胞水平上(A549和HL60)初步评价了单体化合物的抗肿瘤活性。从中筛选出了4个高活性的新化合物(18，27，28，44)：化合物18选择性地对HL60细胞表现出抑制活性其IC50值分别为0.13μM；化合物27对两种肿瘤细胞的IC50值分别为0.6和0.8μM；化合物28对两种肿瘤细胞的IC50值分别为2.4和1.7μM；化合物44对两种肿瘤细胞的IC50值分别为1.9和5.4μM。还筛选出8个具有中等抑制活性的新化合物(5，7，9，24，29，43，45，47)：化合物5对两种肿瘤细胞(A549和HL60)的IC50值分别为30.0和20.6μM；化合物7选择性地对A549表现出抑制活性的，其IC50值为10.5μM；化合物9选择性地对HL-60表现出抑制活性的，其IC50值为9.0μM；化合物24对两种肿瘤细胞的IC50值分别为15.1和7.0μM；化合物29对两种肿瘤细胞的IC50值分别为33.8和7.2μM；化合物43选择性地对HL60细胞表现出抑制活性其IC50值分别为15.7μM；化合物45选择性地对HL60细胞表现出抑制活性，其IC50值分别为18.2μM；化合物47选择性地对HL60细胞表现出抑制活性，其IC50值分别为20.8μM。 本文对六株特殊环境来源的真菌和一株微藻的次级代谢产物进行了系统研究，共分离鉴定了106个化合物的结构，包括新化合物42个，高活性新化合物4个，中等活性新化合物8个。本文研究为抗肿瘤新药的研究提供了重要的先导结构，并为海洋药用微生物资源的开发提供了重要的参考。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：Abbreviation

声明

Structures of Compounds

前言

第一篇 三株红树林真菌的次生代谢产物研究及抗肿瘤活性研究

第一章 焦曲霉(Aspergillus ustus 094102)次生代谢产物及抗肿瘤活性研究

第一节菌株复筛

第二节菌株大发酵及浸膏提取分离流程

第三节化合物的结构鉴定1

第三节化合物的结构鉴定2

第四节化合物表征

第五节化合物的抗肿瘤活性评价

第六节化合物的可能生合成机理推测

第七节小结

参考文献

第二章 扩张青霉(Penicillium expansum 091006)的活性次生代谢产物研究

第一节菌株复筛

第二节菌株大发酵及浸膏分离提取流程

第三节化合物的结构鉴定

第四节化合物表征

第五节化合物的抗肿瘤活性评价

第六节化合物的可能生合成机理推测

第七节小结

参考文献

第三章黄曲霉(Aspergillus flavus 092008)的活性次生代谢产物研究

第一节菌株复筛

第二节菌株大发酵及浸膏分离提取流程

第三节化合物的结构鉴定

第四节化合物表征

第五节小结

参考文献

第二篇 三株高盐环境真菌的活性次生代谢产物研究

第四章 柑桔青霉(Penicillium citrinum B-57)的活性次生代谢产物研究

第一节菌株大发酵及浸膏分离提取流程

第二节化合物的结构鉴定

第三节化合物表征

第四节化合物的抗肿瘤活性及抗氧化活性评价

第五节化合物67和68的可能生合成机理推测

第六节小结

参考文献

第五章 青霉菌(Penicillium sp.B-58)的活性次生代谢产物研究

第一节菌株大发酵及浸膏分离提取流程

第二节化合物的结构鉴定

第三节化合物表征

第四节化合物的抗肿瘤活性评价

第五节小结

参考文献

第六章曲丽穗霉(Spicaria elegans)在高盐条件下的次生代谢产物的研究

第一节 菌株大发酵及浸膏分离提取流程

第二节 化合物的结构鉴定

第三节小结

参考文献

第三篇 海洋微藻的活性筛选及其次生代谢产物的初步研究

第七章 海洋微藻的活性筛选及一株金藻(Ruttnera spectabilis H55)的次生代谢产物的初步研究

第一节 48株微藻的抗肿瘤活性筛选

第二节 金藻(Ruttnera spectabilis H55)的活性次生代谢产物研究

第三节小结

参考文献

第四篇 实验部分及综述

第八章 实验部分

第一节 实验仪器、材料及试剂

第二节 抗肿瘤活性及抗氧化活性的检测方法

第三节 真菌培养基的配制

参考文献

第九章综述：特殊环境微生物次级代谢产物的研究进展

结语与创新点

个人简历与本论文相关研究成果

致谢

附图：新化合物的NMR