转化生长因子-β2对体外培养的人角膜内皮细胞增殖活性和形态的影响及其分子机理

摘要

角膜内皮细胞是存在于角膜靠近于房水面的六角形镶嵌排列的单层细胞,对维持角膜的透明有着关键作用。成年人角膜内皮细胞(HCEC)缺乏增殖能力,局部细胞受到损伤后,只能通过邻近细胞体积的增大和移行来填补缺损区,所以六角形HCEC的数量逐年减少,角膜透明度逐渐降低。现有研究结果表明,HCEC停留在细胞周期的早G1期,仍然保持有增殖的潜能。但关于HCEC停留在G1期的具体的细胞与子机制,至今仍不清楚。
　　 转化生长因子β(TGF-β)属于TGF-β超家族的成员,具有调控细胞的增殖、分化、凋亡及组织的损伤后修复等作用。TGF-β2是存在于人房水中的主要的TGF-β类型,可促进小鼠角膜上皮层和基质层的正常发育及内皮层的形成,抑制体外培养的大鼠、兔和牛角膜内皮细胞的增殖、调控牛角膜内皮细胞外基质蛋白的合成以及角膜内皮细胞的损伤后修复。有关TGF-β2对HCEC增殖活性和形态的影响及相关的分子机理,至今还未见到相关的报道。
　　 为了探明TGF-β2对HCEC增殖活性的影响及相关的细胞和分子机理,本文利用体外培养的人角膜内皮细胞系,使用不同浓度的TGF-β2在含10％FBS的DMEM/F12的培养条件下处理HCEC,发现1～15ng/mL的TGF-β2对HCEC的增殖均有抑制作用,在1～9ng/mL的浓度范围内,TGF-β2对HCEC增殖的抑制作用具有浓度依赖性,其中9ng/mL为TGF-β2对HCEC增殖的峰值抑制浓度;9ng/mL的TGF-β2处理HCEC的细胞计数结果显示,TGF-β2处理12h即可抑制HCEC的增殖,抑制作用具有时间依赖性;流式细胞仪检测结果显示,9ng/mLTGF-β2处理后,处于G1/G0期HCE细胞的数量显著增加(P<0.05),并具有时间依赖性。荧光定量PCR结果显示,9ng/mLTGF-β2处理24h后,HCEC对p27kip1的表达量显著增加,48h后p27kip1和印p21ciP1的表达量均显著增加,也具有时间依赖性。以上结果说明,TGF-β2对HCEC具有显著的增殖抑制作用,并具有浓度和时间依赖性,其抑制作用机理很可能是通过先后诱导p27kip1和p21cip1表达量的增加进而将细胞拘留在G1/G0期来实现的。
　　 为了探明TGF-β2对HCEC形态的影响及相关的分子机理,本文首先采用1～15ng/mL的TGF-β2在含10％FBS的DMEM/F12的培养条件下处理HCEC,光学显微镜下观察的结果显示,3～15ng/mL的TGF-β2处理72h可明显增加细胞的贴瓶面积,在3～9ng/mL的浓度范围内,TGF-β2对HCEC形态改变具有浓度依赖性,其中9ng/mL为TGF-β2对HCEC形态的峰值改变浓度;9ng/mL的TGF-β2处理HCEC的光镜观察结果显示,TGF-β2处理HCEC 24h即可增加单个细胞的铺展面积,促进细胞由上皮细胞样变为成纤维细胞样,形态的改变具有时间依赖性;细胞贴附实验表明,9ng/mL TGF-β2处理24h～72h均可明显的增强HCEC贴附能力(P<0.05)。荧光双染色结果显示,9ng/mLTGF-β2处理24h,可增加HCEC胞质中F-肌动蛋白丝和微管的长度,降低细胞中心体区域的荧光强度;处理72h则明显增加HCEC胞质中微丝束的数量和长度,并促进微管遍布于整个胞质空间;HCEC Ⅰ型和Ⅳ型胶原的免疫荧光染色的结果显示,9ng/mLTGF-β2处理72h,可明显增加HCEC单个细胞胞外Ⅳ型胶原的铺展面积,降低其荧光强度;Western blot结果显示,9ng/mLTGF-β2处理24h和72h对HCEC Ⅰ型胶原和Ⅳ型胶原的表达量均没有显著的影响。以上结果说明,TGF-β2通过增加平行于细胞长轴方向的F-肌动蛋白丝的数量、延长F-肌动蛋白丝和微管的长度以及增加Ⅳ型胶原的铺展面积,从而促进HCEC由上皮细胞样向成纤维细胞样的转变、增大单个细胞的铺展面积和增强细胞的贴附能力。
　　 本文研究了TGF-β2对体外培养的人角膜内皮细胞的增殖活性和形态影响作用,旨在探明TGF-β2在人角膜内皮细胞的增殖和形态改变中的作用及其相关的细胞和分子机理,为深入研究人角膜内皮细胞增殖调控的机理提供重要的理论支持,对了解TGF-β2在角膜内皮细胞的损伤修复过程中的作用具有重要的理论意义。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 转化生长因子-β(TGF-β)研究概况

1.1 TGF-β及其信号转导过程

1.2 TGF-β生物学功能

2 角膜内皮细胞研究概况

2.1 角膜内皮细胞形态结构特点

2.2 角膜内皮细胞的生理功能

2.3 角膜内皮细胞的增殖

2.4 角膜内皮细胞的损伤后修复

3 本论文的研究目的和研究意义

第二章 转化生长因子-β2对人角膜内皮细胞增殖的影响

1 实验用品

1.1 实验材料

1.2 实验试剂

1.3 实验中所用溶液配制方法

1.3 主要实验仪器

2 实验方法

2.1 HCEC的培养及其生长特性分析

2.2 不同浓度的TGF-β2处理HCEC

2.3 细胞增殖分析

2.4 TGF-β2处理时间对HCEC增殖的影响

2.5 TGF-β2处理时间对HCEC细胞周期时相的影响

3 实验结果

3.1 HCEC生长曲线

3.3 TGF-β2添加浓度对HCEC增殖的影响

3.3 TGF-β2处理时间对HCEC增殖的影响

3.4 TGF-β2处理时间对HCEC细胞周期时相的影响

4 讨论

4.1 TGF-β2添加浓度对HCEC增殖活性的影响

4.2 TGF-β2处理时间对HCEC增殖活性和细胞周期时相的影响

5 本章小结

第三章 TGF-β2影响人角膜内皮细胞增殖的分子机理

1 实验用品

1.1 实验材料

1.2 实验试剂

1.3 实验中所用溶液配制方法

1.3 主要实验仪器

2 实验方法

2.1 RNA提取相关仪器试剂的准备

2.2 引物设计

2.3 TGF-β2处理HCEC

2.4 总RNA的提取以及其纯度和质量检测

2.5 总RNA的DNase Ⅰ(Promega)处理

2.6 反转录反应

2.7 引物特异性检测

2.8 荧光定量PCR

3 实验结果

3.1 总RNA完整性和引物特异性检测

3.2 TGF-β2对HCEC P27kip1和P21cip1表达量的影响

4 讨论

5 本章小结

第四章 TGF-β2对人角膜内皮细胞形态的影响及其分子机理

1 实验用品

1.1 实验材料

1.2 实验试剂

1.3 实验中所用溶液配制方法

1.4 主要实验仪器

2 实验方法

2.1 TGF-β2添加浓度对HCEC形态的影响

2.2 TGF-β2处理时间对HCEC形态的影响

2.3 TGF-β2对HCEC贴附能力的影响

2.4 TGF-β2对HCEC细胞骨架的影响

2.5 TGF-β2对HCEC分细胞外基质蛋白的影响

3 实验结果

3.1 TGF-β2添加浓度对HCEC形态的影响

3.2 TGF-β2处理时间对HCEC形态的影响

3.3 TGF-β2对HCEC贴附能力的影响

3.4 TGF-β2对HCEC细胞骨架的影响

3.5 TGF-β2对HCEC细胞外基质蛋白的影响

4 讨论

4.1 TGF-β2对HCEC形态和贴附能力的影响

4.3 TGF-β2对HCEC细胞骨架的影响

4.3 TGF-β2对HCEC细胞外基质蛋白的影响

5 本章小结

全文总结

本论文的创新点

本论文的不足

参考文献

附录

致谢

个人简历

在学期间发表的学术论文与研究成果