TNP-LPS和TNP-KLH诱导的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)抗体分泌细胞的分化研究

摘要

虹鳟作为硬骨鱼,代表了免疫系统进化史上的一个重要的阶段,对其免疫系统的研究具有重要的意义。针对三硝基苯基.脂多糖(TNP-LPS,TL,T细胞非依赖性1型抗原),三硝基苯基.匙孔血蓝蛋白(TNP-KLH,TK,T细胞依赖性抗原)以及三硝基苯基-匙孔血蓝蛋白-脂多糖(TNP-KLH-LPS,TKL,嵌合抗原)免疫的虹鳟,对免疫后虹鳟的血液,脾脏和肾脏中的不同发育阶段的抗原诱导的B细胞进行了为期两年的监测。分析了ex vivo抗体分泌细胞,浆细胞,in vitro抗原可诱导B细胞的组织分布及动态变化。同时,虹鳟是世界上广泛养殖的重要冷水鱼,现在鲑鳟类养殖用的疫苗主要是革兰氏阴性细菌苗,保护性免疫通常是菌苗和佐剂一起使用。但是这种疫苗剂型会影响其经济价值。若要制备更有效的对鱼体无损害的疫苗,就必须明了其免疫系统的作用机制。本文通过比较这三种抗原的在细胞水平上的免疫效果,为设计更为行之有效的水产疫苗奠定基础。对免疫后的四组虹鳟(TL,TK,TKL,对照)在第0,6,16,25,35,44周取血,每组每次取3至10条,运用酶联免疫吸附实验(ELISA)对抗体效价和抗体亲和力进行分析。抗体效价结果表明,TL和TKL抗原的抗体反应均在16周至25周之间出现峰值。TL和TKL显示了快速而激烈的初次免疫应答。TK抗原的初次应答较为迟缓平稳。TKL较TL反应更快更高一些,显示了嵌合抗原的优势。对亲和力的研究显示,这三种抗原均呈现出不同程度的亲和力成熟。TK和TKL组与TL组相比具有较高的亲和力,TKL的亲和力最高,亲和力成熟亦最为显著,再次表明了嵌合抗原优于TL和TK。
　　 在免疫后的第0,6,16和44周解剖鱼体,每组每次3至4条,分别取血,脾脏,前肾和后肾4种组织,收集组织中的淋巴细胞进行ex vivo和in vitro培养,用细胞周期抑制剂羟基脲(HU)在in vitro培养过程中来区分浆母细胞(HU抑制其细胞周期)和浆细胞。淋巴细胞的in vitro可诱导能力是由在in vitro培养过程中加入特定浓度的TL抗原来诱导淋巴细胞来确定的。而后采用酶联免疫斑点技术(ELISPOT)定量组织中的抗体分泌细胞,观察抗体分泌细胞(浆细胞和浆母细胞)在各种组织中的分布情况。从ELISPOT结果来看,大量浆细胞(约85％)存在于虹鳟的前肾(相当于哺乳动物的骨髓),而在血液,脾脏和后肾的均有较少的分布。浆母细胞和可诱导淋巴细胞(未成熟淋巴细胞和免疫记忆细胞)主要分布于外周血淋巴(72％)中,,在脾脏(14％)和前肾(16％)中的分布极少。对ex vivo的ELISPOT分析证明,自发的抗体分泌细胞主要存在于前肾中(86％)。后肾中可分离出来的白细胞数量很少,所以从总体来看其所含有的浆细胞,浆母细胞和可诱导淋巴细胞都比较少。针对三种不同的抗原,浆母细胞和浆细胞以及未成熟淋巴细胞和记忆细胞的组织分布情况大致相同。就其诱导产生的抗体分泌细胞的数量而言,TKL显示出了极大的优势,TK也同样产生了很好的免疫反应和免疫记忆。TL免疫后的白细胞,抗原诱导的in vitro反应,血细胞和脾细胞呈现出50到100倍的增加,而前肾中的白细胞仅增加了10倍。TD免疫后的白细胞,in vitro培养抗原诱导后,血细胞和脾细胞呈现出500倍的增加,而前肾中的白细胞仅增加了30倍。
　　 第46周分别用TL和TK抗原二次免疫TL组和TK组来分析TI-1抗原和TD抗原在硬骨鱼的产生免疫性记忆的能力。二次免疫后,分别在第16和46周取血,脾脏和前肾每组每次4尾,从抗体效价,抗体亲和力以及产生抗体分泌细胞的数量来看,这两种抗原均可使鱼体产生免疫性记忆。这与哺乳动物的只有对TD抗原才能产生免疫记忆的现象不同,虹鳟对TI-1抗原的二次免疫应答要比TD抗原更快更激烈。
　　 对不同时间点收集的淋巴细胞进行HU定时(每24hr添加1次)添加实验,来分析B细胞在硬骨鱼主要免疫组织(血液,脾脏和前肾)中的的增殖分化情况。它可以确定三种细胞的量:1)处于分裂增殖状态的抗体分泌细胞(如浆母细胞),2)诱导的可以过渡到早期浆细胞的浆母细胞(由HU敏感变为HU不敏感),3)稳定的浆细胞(HU不敏感)。结果表明,不管是在初次免疫后还是二次免疫后,血液中自细胞的in vitro反应仅是由浆母细胞组成。而脾脏中,in vitro诱导的浆母细胞则可以分化为短寿浆细胞。与之相反的,免疫后16周前肾拥有一定数量的浆细胞。在前肾淋巴细胞的in vitro培养中添加TL抗原和HU对其几乎没有影响,它们在培养的初始就已经出现,并且一直存在于培养的过程中。这表明前肾中的大部分B淋巴细胞为B细胞分化的最终阶段即浆细胞。
　　 运用流式细胞仪分析各时间点包括第0,16,44,62,92周收集的主要免疫组织的B细胞的B细胞受体(BCR)亲和力。与抗体的亲和力成熟相似,各种组织的B淋巴细胞的BCR亲和力亦随着免疫时间呈现出亲和力的成熟。