养殖大菱鲆波豆虫的分离培养、敏感性药物分析及分子鉴定

摘要

鱼波豆虫(Ichthyobodo necator)隶属于鞭毛纲(Class flagellates)，动基体目(Order Kinetoplastida)，是主要的鱼类体外寄生虫之一，广泛寄生于全球范围内的多种养殖淡水鱼类，严重危害着世界鱼类养殖业。近年来，世界各地在一些严格意义的海水鱼类上都发现了与鱼波豆虫非常相似的鞭毛虫类寄生虫。这表明鱼波豆虫病可能不仅仅只是一个种的鞭毛类原生动物引起的。我国关于鱼波豆虫病的研究多集中在淡水养殖鱼类的疾病防治方面，海水养殖鱼类感染鱼波豆虫病的事例鲜有报道及研究。本研究此次在山东潍坊地区养殖大菱鲆(Scophthalmusmaximus)苗种上发现的鱼波豆虫病，是我国鱼波豆虫病在养殖大菱鲆上的首次报道。鉴定此次大菱鲆寄生虫病病原并进行相应的初步研究，可以为我国海水养殖鱼类感染鱼波豆虫病的研究积累一定的基础资料并为我国大菱鲆(Scophthalmusmaximus)养殖中鱼波豆虫病的防治提供理论参考。
　　 本研究共分四个部分：通过现场调查，显微观察和扫描电镜观察等基础诊断方法对大菱鲆鱼波豆虫病进行初步诊断并得到其病原的形态学特征；利用原生动物微量分离方法成功分离出大菱鲆鱼波豆虫病病原并进行实验室培养条件初步探索；选取四种常用鱼病治疗药物进行鱼波豆虫敏感药物筛选试验；设计鱼波豆虫特异性引物进行PCR分子扩增反应，结合序列比对构建鱼波豆虫中国株的系统进化树。
　　 1.养殖大菱鲆感染波豆虫病症及病原观察。分别利用光学显微镜和扫描电子显微镜进行大菱鲆鱼波豆虫病病原形态学观察与分析并得到了中国区系以大菱鲆苗种为宿主的病原形态学显微照片，分析其形态学特征，确定此次我国北方潍坊地区大菱鲆苗种爆发的寄生虫病病原为鱼波豆虫(Ichthyobodo necator)。同时通过对山东半岛其他海水鱼类寄生虫的调查发现了三种其他寄生虫，分别为：盾纤毛虫、淀粉卵涡鞭虫和一种未定种纤毛虫。
　　 2.利用原生动物微量分离方法成功分离出病原鱼波豆虫，筛选鱼波豆虫实验室培养最佳培养条件。结果得出0.3g/L牛肉浸膏培养液中，鱼波豆虫能够很快进入指数增长期，种群密度达到一个较高值，但持续时间不长，很快进入衰退期。鱼波豆虫在1％的鱼鳃组织匀浆上清培养液(EG培养液)中培养96h时，种群密度达到所有实验组中的最高种群密度，达到了450000ind/mL且在4天内种群密度都保持在较高密度水平，种群在10天内都保持在一个较为理想的生存状态，且种群自然增长率明显高于牛肉浸膏培养液试验组。因此实验室长时间维持培养选择1％的鱼鳃组织匀浆上清培养液较为理想。不同温度、盐度条件下，中国区系鱼波豆虫生长情况结果显示：鱼波豆虫在4-30℃均可生存，22℃为其最佳生长繁殖温度。盐度对鱼波豆虫生长繁殖影响不显著，但本试验中的鱼波豆虫在淡水环境中并未能正常生长。
　　 3.试验使用的四种常用药物硫酸铜、硫酸铜-硫酸亚铁合剂、高锰酸钾和福尔马林对鱼波豆虫都具有一定的灭杀效果，但综合多种因素考虑，高锰酸钾作为常用的灭菌剂，具有无残毒无副作用，无异味施用方便，价格低廉等优点，因此在治疗大菱鲆鱼波豆虫病时可优先考虑。
　　 4.利用PCR扩增技术以中国山东潍坊地区大菱鲆苗种上的鱼波豆虫病原DNA为模板，进行分子生物学鉴定。鉴定结果显示：本次中国海水鱼类身上发现的鱼波豆虫与多个国家不同种鱼波豆虫都具有较高相似度。通过将本实验对象与选取的14株不同国家不同宿主的鱼波豆虫序列比对分析进行系统发育研究后发现：中国地区以大菱鲆苗种为宿主的鱼波豆虫在亲缘关系上与巴西国王黑鲷上寄生的鱼波豆虫同属一枝，与美国鲈属类上寄生的和剑尾鱼上寄生的鱼波豆虫也存在较近的亲缘关系，但可以明显看出中国发现的这株鱼波豆虫与这三个鱼波豆虫种存在一定的差异并不应同属一种，因此推测可能为中国大陆特有鱼波豆虫虫种。