江蓠中类菌孢素近氨基酸(MAAs)分离纯化及应用研究

摘要

类菌孢素氨基酸(mycosporine-like amino acids，MAAs)是广泛存在于海洋生物尤其是藻类植物中的特异化合物，具有较强的紫外吸收特性。目前，学者们发现在北美洲、澳大利亚、欧洲沿海海域生存的多种藻类均含有种类丰富的MAAs物质。中国海岸线较长，沿海海域海藻种类也较为丰富，但对于藻类中的MAAs研究则较少，尤其是已经实现人工养殖的江蓠、紫菜、裙带菜等大型藻类均亟待研究，以提高其应用价值。本文以湛江产江蓠为原料，对其含有的MAAs物质的主要成分进行了鉴定，通过正交旋转试验得到了江蓠中MAAs粗提物的最优提取工艺，比较了几种离子交换树脂对MAAs提取物的纯化效果，确定了最佳纯化条件，并初步研究了MAAs提取物在防晒霜中的应用并验证了Porphyra-334纯化物对小鼠B16黑色素瘤细胞的细胞安全性。
　　 1.对湛江人工养殖江蓠进行了紫外线吸收物质-MAAs(Mycosporine-likeamino acids)的提取鉴定，并对主要成分及其含量进行了分析，结果发现湛江产江蓠(Gracilaria changii)MAAs提取物中主要含有以下四种MAA成分：Palythine、Shinorine、Palythinol和Porphyra-334，其中Porphyra-334和Palythine含量较高。应用高效液相色谱法(HPLC)和紫外分光光度法(UV)对Porphyra-334成分进行测定，在此基础上，通过数据处理分析，建立了一种快速、有效和准确的MAA类紫外吸收物质检测方法。
　　 2.以江蓠中几种MAA类物质的得率为考察指标，在单因素试验的基础上，采用正交旋转组合试验设计方法，建立了甲醇溶液浸提MAAs的二次回归模型，以MAA类物质的得率为响应值进行响应面分析，确立醇提MAAs的优化工艺条件为：提取温度48.12℃，液固比34:1，甲醇浓度25％，浸提时间1.85h，优化条件下预测提取率为4.943mg/g：试验值为4.893mg/g。
　　 3.比较了D152、D61、001×7、D001、SA-2几种离子交换树脂对MAAs提取液分离纯化的效果。通过静态吸附试验筛选出吸附量和解析率最高的树脂SA-2，在pH=3左右，其对粗提物的最大吸附量可达10.01mg/g，碱性条件下洗脱率最高；利用Freundlich等温线模拟ln(qe)=bln(Co)+a(其中qe为平衡时的吸附量，Co为提取液中MAAs的初始浓度)，得a=1.16，b=1.12。比较试验测定结果得到最适上样浓度为3～5mg/mL，通过离子交换树脂动态吸附和解析试验确定利用SA-2树脂动态纯化MAAs的工艺参数为：粗提物母液用超纯水稀释到4mg/mL，保持粗提液pH值3左右时上柱；上柱流速为2BV/h，上柱后吸附4小时，洗脱液为浓度2％的氨水，收集洗脱液冷冻干燥后进行HPLC检测，MAAs化合物纯度为46.2％，样品得率为89％，与纯化前粗提物的纯度(17.6％)相比提高了两倍左右，该方法纯化效果较好。
　　 4.将纯化后的紫外吸收物质MAAs添加到化妆品配方中制成防晒膏，并进行了低温、高温、光照稳定性和微生物测试，结果表明产品物理性能稳定，感官效果符合防晒膏感官评价指标，可用于皮肤试验。用紫外分光光度计测定样品防晒系数，结果表明添加MAAs样品组较对照组及空白组在300～340nm范围内有较高的紫外吸光值。通过测定Porphyra-334对B16小鼠黑色素瘤细胞增殖率及细胞形态的影响，验证了江蓠中主要成分Porphyra-334的细胞安全性。