菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究

摘要

碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)是生物体内一种重要的调控酶，可催化各种磷酸基团的水解和转移反应。在生物体内，ALP广泛参与鱼类葡萄糖、脂类、无机磷及钙的吸收，维持适当的钙磷比例，并且在贝类动物贝壳形成过程中起到重要作用。纯化后的ALP被广泛应用在酶免疫分析和基因工程领域。目前应用的ALP主要是从大肠杆菌、牛小肠中分离纯化得来，但其理化性质存在局限性，如大肠杆菌最适反应温度为80℃，在25℃条件下没有酶活力；牛小肠ALP在DNA克隆和扩增中不易热失活等，促使研究者不断探索、发现新来源的ALP。
　　 鉴于海洋生物其独特的生活环境，海洋生物逐渐成为新型活性物质的珍贵材料来源。本课题对海洋软体动物菲律宾蛤仔的ALP进行分离纯化，优化ALP分离纯化工艺，并进一步研究其酶学性质。相关研究内容及结果如下：
　　 1.菲律宾蛤仔体内ALP组织性差异研究表明，酶活性顺序由大到小依次为内脏团、鳃、斧足和外套膜。对菲律宾蛤仔内脏团ALP活性的季节性差异研究表明，四个季节中酶活性均较高，但以春节ALP活性最高，夏季次之。
　　 2.采用硫酸铵盐析沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析等步骤，从菲律宾蛤仔内脏团中分离得到ALP，提纯倍数为14.42，比活力达到131.08 U/mg。SDS-PAGE显示为单一条带，亚基分子量约为44 kDa。
　　 3.菲律宾蛤仔ALP最适反应温度约为45℃，最适反应pH约为9.0，在25℃条件下具有较高的酶活性，而且具有较高的pH耐受性，在pH7-pH11范围内均具有较高的酶活性和稳定性。以PNPP为底物，用Lineweaver Burk法作图，得到菲律宾蛤仔ALP动力学参数为：Km=0.098mmol/L，Vmax=1.01μmol/(mL·min)。
　　 4.金属离子对ALP酶活性的影响研究表明，Na+、K+、Ca2+、Mg2+对酶活力均有不同程度的激活作用，其中，Ca2+、Mg2+对酶活力的激活作用最显著。Mn2+和Fe3+在低浓度时，对酶具有激活作用，随着在反应体系中浓度的增大，对酶又具有不同程度的抑制作用。此外，Ba2+、Cu2+对ALP也具有一定的抑制作用。
　　 5.有机溶剂对酶活性的影响研究表明，甲醇、乙醇和异丙醇对ALP酶活力具有很强的抑制作用，并且随着浓度的增加，抑制作用增大，当浓度达到40％时，实验组相对酶活力分别为5.23%、3.13%和2.09%。可见，有机溶剂的非极性越大对ALP的抑制作用越大。
　　 6.对菲律宾蛤仔ALP功能基团进行化学性修饰，发现组氨酸和二硫键是其必需功能基团，而丝氨酸、赖氨酸、色氨酸和巯基不是其必需功能基团。