Hg2+对P.leiognathi及荧光素酶体外发光体系发光性能的作用机理研究

摘要

本文通过研究有毒重金属Hg2+对鳆发光杆菌YL(Photobacterium leiognathi)发光性能的影响途径，为今后其它有毒物质的研究提供参考。以探索P.leiognathiYL的进一步开发和利用提供理论依据为出发点，研究了Hg2+在不同的作用方式下对P.leiognathiYL的细胞活性、发光特性和lux基因表达水平的影响。在此基础上又进一步分离纯化了细菌发光系统中最重要的酶一荧光素酶，并研究了Hg2+对荧光素酶的发光动力学影响。
　　 1、对P.leiognathiYL与发光相关的基本生理特性规律进行了研究。P.leiognathiYL的菌体发光强度高，肉眼可见。细菌在25℃，150 r/m i n摇床恒温培养条件下，4h开始进入对数生长期，9h进入生长稳定期，可持续稳定发光20h以上。建立的检测P.leiognathi YL活菌数的MTT法与比浊法相比，能更准确和真实的反映活菌数量。同时MTT法又比平板稀释法、自动菌数测定仪法、血球板计数法等更方便且受干扰因素少。建立的检测标准曲线的线性关系为，y=0.0495x+0.02，R=0.9997。使用MTT法及RTQ-PCR法，绘制了P.leiognathi YL以生长状态为参考的发光曲线和lux基因表达曲线。
　　 2、Hg2+抑制P.leiognathi发光的机理研究。以国标GB/T15441-1995，水质急性毒性的测定一发光细菌法为参照，建立了P.leiognathi YL发光强度与Hg2+浓度的线性关系，并研究了在此线性范围内Hg2+对P.leiognathi YL的细胞活性，发光强度，lux基因表达量及体内荧光素酶活性的影响。结果包括：1)在0-0.2mg/L的Hg2+浓度范围内，Hg2+的浓度与其对P.leiognathi YL的发光抑制率呈良好的线性关系，其相关系数R2>0.98；2)在此范围内，P.leiognathi YL菌体的死亡率与P.leiognathi YL发光受抑制的程度也具有良好的相关性(R2>0.96)；3)虽然lux基因的表达也受到了一定程度的抑制，但其变化与P.leiognathi YL的发光变化没有明显的相关性；4)Hg2+没有影响到细菌体内的荧光素酶的活性(p>0.01)。从实验结果来看，Hg2+对P.leiognathi YL的发光抑制主要是导致了细菌的死亡。从SEM图上可以直观的看到细菌的死亡状态。
　　 3、Hg2+在P.leiognathi生长过程中的作用。将Hg2+添加到了细菌的液体培养基中，研究了Hg2+在P.leiognathi YL生长过程中对细菌生理特性的作用。在同样的培养条件下，Hg2+环境中细菌的生长和发光在时间上都出现了延迟，但可以达到最高的发光强度。当以细菌数量为参考坐标比较时，相同的菌体密度下，在Hg2+的环境中生长的P.leiognathi YL的发光反而高于正常生理状态下的P.leiognathi YL。P.leiognathi YL的发光强度与lux基因表达的积分值具有相关性，且两种情况下的对应关系相同。从实验组细菌中提取的荧光素酶的活性与对照组的没有显著性差异(p>0.01)。从实验结果来看，Hg2+诱导了lux基因的表达，从而改变了P.leiognathi YL的发光规律。但是lux基因对菌体发光的调控及体内发光系统都没有受到影响。
　　 4、纯化荧光素酶，研究了Hg2+对荧光素酶发光动力学的影响。通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析和DEAE-Sephadex A50离子交换柱层析的方法分离纯化了荧光素酶，获得了电泳纯的酶蛋白组分，其两个亚基的分子量分别为41KDa和36Kda，与文献报道一致。研究了Hg2+对荧光素酶的动力学抑制类型。Hg2+对荧光素酶以FMNH2为底物的抑制类型为反竞争性抑制，以Dodecane为底物的抑制类型为非竞争性抑制。