红树林来源Streptomyces sp.OUC6819中多烯大环内酯类抗生素的生物合成研究

摘要

Streptomyces sp.OUC6819分离于我国广东省红树林保护区芦苇根际土壤，能够产生一类具有抗真菌活性的32元多烯大环内酯类化合物(Polyene Macrolides，PEMs)。本论文以Streptomyces sp.OUC6819为研究对象，主要围绕PEMs的生物合成开展了以下研究工作：
　　首先，对Streptomyces sp.OUC6819最适的生长条件进行了摸索。在不同培养基(MS，ISP2，ISP4，COM，高氏)，盐浓度(0％~10%)条件下培养，实验结果确定最佳产孢培养条件为ISP2培养基，28℃，盐浓3.3%，pH=7.2。通过抗性敏感实验确定了Streptomyces sp.OUC6819对Thiostrepton、Kanamycin和Erythromycin的敏感性。
　　其次，成功构建了Streptomyces sp.OUC6819的基因组文库。从Streptomyces sp.OUC6819中提取基因组DNA，经过Sau3A I部分酶切，脱磷，回收35-45kb左右的DNA片段，与经XbaI酶切并脱磷，再用BamHI处理的载体SuperCos1相连接，连接产物经包装蛋白包装，然后侵染宿主细胞Escherichia coli Trans10，构建成Streptomyces sp.OUC6819的基因组文库。对该文库进行了质量鉴定，结果表明：文库的效价达6.0×106cfu/mL，经EcoRI、BamHI和XhoI酶切验证基因文库随机性良好。所建文库的各项指标均达到要求，克隆子分装保存于-80℃冰箱。基因组文库的构建为次级代谢产物生物合成基因簇的克隆，基因功能研究以及异源表达奠定了基础。
　　接着，对Streptomyces sp.OUC6819中多烯大环内酯类生物合成基因簇进行了克隆与生物信息学分析。研究结果表明，多烯大环内酯类化合物生物合成整个基因簇共98kb，由14个开放阅读框(Open Reading Frames，ORFs)组成，其中有4个I型聚酮合酶(Polyketide synthase，PKS)基因(opeG、opeH、opeI和opeJ)，5个可能的调控基因(opeA、opeC、opeD、opeE和opeF)，1个抗性基因(opeK)，1个II型硫酯酶基因(opeM)，1个CoA连接酶基因(opeN)和两个未知功能基因(opeB和opeL)。本论文采用PCR targeting方法构建了用于调控基因opeA、opeC和opeF双交换同源重组的质粒ZH1、ZH2、ZH3，通过接合转移方法将重组质粒ZH3导入野生株Streptomyces sp.OUC6819之中，获得了opeF基因阻断突变株。对野生株和opeF基因突变株进行发酵，经HPLC-MS分析表明：突变株丧失了多烯大环内酯(分子式C36H58O10)的合成能力，证实了opeF基因是多烯大环内酯生物合成中的正调控子。
　　最后，在转录水平上研究了opeF基因对基因簇中其它基因的调控，RT-PCR结果表明，opeF基因是以正调控方式调控基因簇中的opeA、opeE、opeF、opeG、opeK、opeM和opeN基因，这为进一步进行基因工程改造提供理论支持。

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第一章 前 言

1.1 研究背景

1.2 海洋放线菌研究的历史

1.3 海洋放线菌的分布和分类

1.4 海洋放线菌来源的次级代谢产物

1.5 多烯大环内酯类化合物

1.6 本研究的目的和意义

第二章 Streptomyces sp.OUC6819最适生长条件的摸索

2.1引言

2.2 实验材料

2.3实验方法

2.4实验结果与分析

2.5小结

第三章 Streptomyces sp.OUC6819基因组文库的构建

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果与分析

3.5 小结

第四章 多烯大环内酯类生物合成基因簇的克隆与鉴定

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果与分析

4.5 小结

第五章 opeF基因调控机制的研究

5.1 引言

5.2实验材料

5.3实验方法

5.4实验结果与分析

5.5小结

第六章 结语与创新点

6.1结语

6.2创新点

6.3未来工作展望

参考文献