一株抗白色假丝酵母菌的解淀粉芽孢杆菌的初步研究

摘要

芽孢杆菌次级代谢产物中的抑菌物质主要是脂肽（lipopeptide）类化合物，主要包括表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和丰原素（fengycin）3大类，它们通常具有抑制细菌、真菌、病毒以及支原体的作用，对由真菌或病毒引起的疾病的治疗工作具有重要的研究意义。脂肽分子由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成，正由于它的两亲性结构特点，在食品工业、医药、农业生产等方面都有着广泛的应用价值。
　　本论文从多株有抑制真菌能力的菌株中筛选出抑菌活性最强的anti-CA菌株。通过对该菌株菌落形态鉴定以及16S rDNA序列分析，结果表明该菌株与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）特征相符，并且16S rDNA序列具有高度的同源性，因此鉴定为解淀粉芽孢杆菌。anti-CA菌株能够杀死人类条件致病菌白色假丝酵母菌（Candida albicans）。
　　通过对anti-CA菌株产抗菌活性物质的培养条件优化，确定了该菌株产抗菌活性物质的最佳培养条件为：豆饼粉2.0％（w/v），面粉1.0%（w/v），pH6.5，培养温度28℃，180 rpm振荡培养27 h。通过2-L发酵罐进行发酵实验，结果表明anti-CA菌株发酵培养21 h时进入生长稳定期，菌体量保持在3.3×108个/mL，发酵27 h时抗菌活性物质抑菌效果达到最大，经抑菌活性实验检测抑菌圈直径为31.33mm，发酵时间为33 h时进入衰亡期。酶活力测定结果显示淀粉酶活力可达110.75U/mL，蛋白酶活力可达到3.82U/mL，为以后anti-CA菌株工业化大规模发酵生产抗菌活性物质奠定了基础。发酵上清液经过酸沉淀、抽提，薄层层析和高效液相色谱法（HPLC）等步骤分离纯化出一种抗菌脂肽。质谱分析表明，此脂肽分子量为1021，分子式为C52H91N7O13。纯化的抗菌脂肽在28℃，pH为7.0的抑菌检测平板上对C. albicans抑菌活力最高。
　　对纯化的anti-CA菌株抗菌脂肽的抑菌机理进行初步探究：纯化的抗菌脂肽不仅可以杀死完整的敏感酵母C. albicans细胞，也可以杀死C. albicans细胞的原生质体。电镜检测发现，被抗菌脂肽处理过的C. albicans细胞的细胞壁表面内陷并且发生皱褶，细胞内基质外泄。荧光染料染色检测发现，经过抗菌脂肽处理后的C. albicans细胞可以被PI染料染成红色，而正常细胞不被染色，这说明了该抗菌脂肽能够破坏敏感酵母菌C. albicans细胞膜的通透性。

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第一章 绪 论

1.1前言

1.2解淀粉芽孢杆菌的应用现状

1.3解淀粉芽孢杆菌的抗菌脂肽介绍

1.4抗菌脂肽的作用机制

1.5抗菌脂肽的研究发展前景

1.6本研究的目的意义以及内容

第二章 有抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌的筛选和鉴定

2.1

2.2实验材料

2.3实验方法

2.4结果与讨论

2.5本章小结

第三章 anti-CA菌株发酵培养基的优化和抗菌条件的优化

3.1

3.2实验材料

3.3实验方法

3.4结果与讨论

3.5本章小结

第四章 解淀粉芽孢杆菌的发酵及抗菌脂肽的分离纯化

4.1 前言

4.2实验材料

4.3实验方法

4.4实验结果与讨论

4.5本章小结

第五章 anti-CA菌株抗菌脂肽的抑菌机理的初步研究

5.1 前言

5.2实验材料与方法

5.3实验结果与讨论

5.4本章小结

参考文献

附录：英文缩写符号及其中英文名称

致谢

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