牙鲆vasa基因的克隆、表达分析及其启动子调控的GFP报告载体构建

摘要

原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs）是有性生殖动物生殖细胞的祖细胞，在早期胚胎中形成后迁移到性腺原基，并最终产生卵和精子。Vasa属于ATP依赖的RNA解旋酶中DEAD-box家族。自发现以来，vasa被认为是生殖细胞最可信的分子标记之一，在生殖系的起源、发育以及配子形成过程中发挥重要作用。牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我国最重要的海水经济鱼类之一，对其生殖发育以及优良种质资源保存的研究具有重要意义。本文克隆了牙鲆Po-vasa的全长序列，并进行了序列特征分析和表达分析。通过染色体步移技术获得Po-vasa启动子序列，并构建了启动子调控的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）报告载体pvasa-EGFP，为将来追踪和分离牙鲆PGCs奠定基础。
　　牙鲆Po-vasa cDNA全长2461 bp，其中ORF1941 bp，编码646个氨基酸。5?UTR为175 bp，3?UTR为345 bp。预测的氨基酸序列具有 DEAD-box家族蛋白所共有的9个保守结构域以及普遍存在于许多物种 Vasa蛋白 N末端的RG和RGG重复序列。结合染色体步移技术，最终得到牙鲆基因组中11443bp的片段。该片段包括了6927 bp的牙鲆vasa基因全长，3333 bp的5?侧翼区和1183 bp的3?侧翼区。Po-vasa基因全长共23个外显子和22个内含子，起始密码子位于外显子II中。
　　荧光定量PCR分析显示，在十种不同组织中Po-vasa的表达仅限于性腺，其中卵巢内的表达水平显著高于精巢内的表达水平；胚胎发育早期 Po-vasa为母源性表达，原肠胚期之前表达量高且较稳定，在原肠期表达量骤降，低水平表达持续到孵化后1天。
　　通过对Po-vasa的PCR扩增及测序，发现存在10种选择性剪接产生的不同的5?部分序列，而3?部分未见差异。因此推测牙鲆vasa基因至少存在10种选择性剪接异构体，编号 A~J。A为本实验最初克隆到的也是最主要的一种转录本。异构体J由于缺失了8个碱基导致了移码突变，其他异构体则均包含DEAD家族的9个保守结构域。对异构体B~J进行相对定量分析结果表明，不同异构体在性腺中的表达量不同，F表达量最高；同种异构体在精巢和卵巢的表达量也存在差异，如E和F。这些异构体在早期胚胎发育时期的表达模式也不尽相同。因此，不同异构体可能行使着不同的功能。
　　利用多种在线分析软件对 Po-vasa3.3kb的启动子区域进行生物信息学预测分析。在转录起始点TSS上游31 bp处有1个典型的TATA box。启动子区存在GATA-1、C/EBP、AP-1、SP-1、Oct-1、MZF1、c-Myc、SRY、Sox-5、AML-1a、HNF-3B等多个转录因子结合位点及多个糖皮质激素受体GR的结合位点，推测其可能对Po-vasa的调控起到关键作用。
　　PCR扩增Po-vasa的5和3调控序列，与增强型绿色色荧光蛋白（EGFP）基因连入载体，构建牙鲆Po-vasa启动子调控的GFP报告载体。将来经过进一步研究分析启动子效率和绿色荧光蛋白在PGCs中的特异表达，可以为PGCs起源和迁移的研究以及分离PGCs提供基础。

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第一章 文献综述

1 vasa基因研究进展

2 鱼类生殖细胞的研究概况

3 本研究的意义

第二章 牙鲆vasa基因的克隆和序列特征分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三章 牙鲆vasa基因的表达分析

1材料与方法

2 结果

3 讨论

第四章 牙鲆vasa基因不同异构体的表达分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第五章 牙鲆Po-vasa启动子调控的GFP报告载体构建

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

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