大豆浓缩蛋白调控瓦氏黄颡鱼幼鱼摄食和蛋白质代谢的研究

摘要

本文以我国重要的淡水养殖鱼类瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)幼鱼为研究对象,采用分子生物学和摄食生长实验相结合的手段探究大豆浓缩蛋白调控瓦氏黄颡鱼幼鱼摄食和蛋白质代谢的机理。通过同源克隆技术获取调控瓦氏黄颡鱼摄食和蛋白质代谢的关键基因,在此基础上对比探究大豆浓缩蛋白与其他三种蛋白源形式(鱼粉、水解鱼蛋白和氨基酸混合物)对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长、存活以及蛋白质代谢相关基因表达的影响,并深入探讨不同大豆浓缩蛋白替代水平和不同限饲水平对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长、存活以及摄食和蛋白质代谢相关基因的表达。探明大豆浓缩蛋白是否是通过调控瓦氏黄颡鱼摄食和蛋白质代谢来影响其替代效果,从而为瓦氏黄颡鱼产业健康可持续的发展提供科学依据。本文的研究内容和主要研究结果如下:
　　1.瓦氏黄颡鱼摄食和蛋白质代谢相关基因的克隆、序列分析及组织差异性表达
　　利用同源克隆技术和RACE技术分别从瓦氏黄颡鱼脑、前肠和肝脏中成功扩增出神经肽Y(NPY)和小肽转运载体(PEPT1)的全序列以及雷帕霉素靶蛋白(TOR)的核心序列。NPY基因全长为661bp(Genbank No:JN411578),开放阅读框长度为285bp,编码95个氨基酸,预测分子量为10.82 kDa,理论等电点为5.8。BLAST分析表明瓦氏黄颡鱼NPY基因氨基酸序列与其它物种具有很高的同源性,但N-端变异较大。PEPT1基因全长为2728bp,开放阅读框长度为2160 bp,编码720个氨基酸,其氨基酸分子重为80.95kDa,理论等电点为5.47,无信号肽,BLAST分析表明瓦氏黄颡鱼PEPT1基因氨基酸序列与其它物种具有很高的同源性,其N-端保守度非常高,组织差异性表达分析表明,其主要分布于前肠;TOR的核心片段长度为594bp,可编码198个氨基酸。相关基因的克隆有助于从分子角度阐释饲料营养成分调控瓦氏黄颡鱼摄食和蛋白质代谢的机理。
　　2.大豆浓缩蛋白与三种蛋白源对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长、存活以及蛋白质代谢相关基因表达影响的比较研究
　　以初始体重为2.90±0.01g的瓦氏黄颡鱼幼鱼为研究对象,比较研究大豆浓缩蛋白与其它三种蛋白源(鱼粉、水解鱼蛋白和氨基酸混合物)对其生长、存活以及下丘脑NPY和肝脏TOR基因表达的影响。配制4种等氮(蛋白含量为39％)等脂(脂肪含量为9%)的实验饲料,其中主要蛋白源分别为大豆浓缩蛋白、鱼粉、水解鱼肉蛋白和晶体氨基酸。养殖周期为66天,每天饱食投喂2次(早07:00和晚18:00),实验结果表明,不同蛋白源未对瓦氏黄颡鱼幼鱼的存活产生显著影响,但对生长产生显著影响,第35天和第66天各处理特定生长率(SGR)均呈现先下降后上升的趋势,最大值为鱼粉组,最小值为水解鱼肉蛋白处理组(P<0.05);不同蛋白源对瓦氏黄颡鱼幼鱼前肠PepT1mRNA表达产生了显著影响(P<0.05),第35天各处理前肠PepT1mRNA表达水平与生长结果类似,但第66天SPC处理组PepT1mRNA表达水平显著上升,达到最大值,最小值仍为水解鱼肉蛋白处理组(P<0.05)。不同营养水平未对瓦氏黄颡鱼幼鱼肝脏TOR基因mRNA表达产生显著影响(P>0.05)。本研究表明,大豆浓缩蛋白的替代效果尽管低于鱼粉,但仍显著优于水解鱼肉蛋白和晶体氨基酸混合物,这可能是通过提高前肠PepT1表达水平来实现的。
　　3.不同大豆浓缩蛋白替代水平对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长、存活以及摄食和蛋白质代谢基因的影响
　　以初始体重为2.90±0.01g的瓦氏黄颡鱼幼鱼为研究对象,探讨不同大豆浓缩蛋白替代水平的饲料对其生长、存活、下丘脑NPY基因、小肽转运载体PEPT1和肝脏TOR基因mRNA表达的影响。配制3种等氮(蛋白含量为39%)等脂(脂肪含量为9%)的实验饲料,其中大豆浓缩蛋白替代水平分别为0%、40%和100%,分别命名为FM组、SPC40%组和SPC100%组。养殖周期为66天,每天饱食投喂2次。实验结果表明:不同大豆浓缩蛋白替代水平饲料未对瓦氏黄颡鱼幼鱼的存活产生显著影响,但对摄食和生长产生显著影响。随着替代水平的升高,第35天各处理组实验鱼摄食率和特定生长率均呈现逐渐下降的趋势,最大值均为FM组,最小值均为SPC100%组;第66天的数据统计分析结果与第35天结果类似,但SPC40%组与FM组的摄食率相比没有显著性差异,特定生长率最大值出现在SPC40%组;随着替代水平的升高,第35天和第66天各处理实验鱼下丘脑NPY基因mRNA表达量均呈现下降的趋势(P<0.05),最大值为FM组;最小值则出现在SPC100%组;第35天和第66天SPC40%组PEPT1基因mRNA表达量与对照组相比均无显著性差异,但第35天SPC100%组表现最小值,而第66天则表现最大值;不同大豆浓缩蛋白替代水平饲料未对瓦氏黄颡鱼幼鱼肝脏TOR基因mRNA表达产生显著影响。本研究表明,饲料中高水平大豆浓缩蛋白能够显著降低瓦氏黄颡鱼幼鱼的摄食率和生长速率,这可能是通过降低NPY基因表达水平来调控的。
　　4.不同限饲水平对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长、存活以及摄食和蛋白质代谢相关基因表达的影响
　　以初始体重为2.90±0.01g的瓦氏黄颡鱼幼鱼为研究对象,研究不同的限饲水平对其生长、存活、下丘脑NPY基因和前肠PEPT1 mRNA表达的影响,以探讨摄食率下降是否是降低大豆浓缩蛋白替代效果的主要因素。实验分为3组,对照组以表观饱食量投喂,其它2组相应的调整为表观饱食量的50%和0%;三个处理组分别命名为饱食组、50%饱食组和饥饿组。实验在循环水养殖系统进行,养殖周期为66天,每天投喂2次(早07:00和晚18:00),35天后对饥饿组进行表观饱食投喂处理。结果表明,不同限饲水平未对瓦氏黄颡鱼幼鱼的存活产生显著影响;随着限饲水平的升高,第35天实验鱼的特定生长率、摄食率和前肠PEPT1表达量均显著下降,但下丘脑NPY基因mRNA表达量呈逐渐上升趋势(P<0.05),对饥饿组饱食投喂后,第66天实验鱼的特定生长率显著高于其他各组,达到最大值,PEPT1表达量也显著上升,但下丘脑NPY基因mRNA表达量有所下降,显著低于50%饱食组(P<0.05)。本研究表明,NPY基因在瓦氏黄颡鱼中具有促食欲作用,其引起的摄食变化可以直接或间接的通过影响PEPT1基因的表达而对鱼体生长进行调控。

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引言

第一章: 文献综述

1、前言

2、影响植物蛋白源替代鱼粉的因素

3、影响蛋白质利用的相关基因的研究进展

4本研究的目的和意义

第二章瓦氏黄颡鱼摄食和蛋白质代谢相关基因的克隆、序列分析及组织差异性表达

1. 引言

2 材料和方法

3 实验结果和讨论

附录

第三章 大豆浓缩蛋白与三种蛋白源形式对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长、存活和蛋白质代谢相关基因表达的比较研究

1. 引言

2 材料和方法

3 实验结果

4 讨论

附录

第四章 不同大豆浓缩蛋白替代水平对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长、摄食和蛋白质代谢相关基因的影响

1 引言

2 材料和方法

3 实验结果

4 讨论

第五章 不同限饲水平对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长、摄食和蛋白质代谢相关基因表达的影响

1. 引言

2 材料和方法

3 实验结果

4 讨论

附录

参考文献

致谢

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