以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)RT130品系为模式生物的环境雌激素活体筛选方法的建立与应用

摘要

环境雌激素是指能够干扰生物体内激素代谢平衡，从而影响生物体生长、发育、繁殖等生理功能的外源性化学物质。1996年以来，环境中的雌激素类物质造成动物生殖畸变、生殖异常以及人精子数减少等现象，已经引起了世界各国的广泛重视。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是一种国际公认的模式生物，易于培养，抵抗环境压力的能力极强，已广泛地应用于环境毒理学研究。RT130品系线虫是由卵黄原蛋白基因vit-2调控报告基因绿色荧光蛋白gfp的基因重组秀丽隐杆线虫。该品系线虫受到紫外光或蓝光激发后肠道处能够发射强烈绿色荧光，可直接通过荧光显微镜观察，荧光信号的强弱可以表征外界雌激素的水平。本文利用RT130品系线虫建立了雌二醇(E2)浓度与荧光强度之间的剂量-效应标准曲线回归方程，初步构建了环境雌激素的活体筛选方法。该筛选方法可应用于实验室内单一目标污染物雌激素当量的测定以及环境中不同水体的综合雌激素效应的实时监测。
　　(1)在不同浓度的E2溶液中暴露后，报告基因gfp在转基因线虫的肠道处表达，从而发出荧光信号，且gfp表达、荧光信号的强弱与雌激素含量呈正相关，荧光信号的强弱具有雌激素依赖性。根据E2的暴露浓度与荧光信号强度之间的关系建立的标准曲线回归方程：y=4.8165e0.22(In(1E12x)/2.3026)(R2=0.9871)该活体筛选方法敏感性高，可筛选出10-10g/L水平的雌激素类物质。
　　(2)利用上述方程可以对单一目标污染物的雌激素效应进行评价。久效磷、双酚A、多氯联苯和氯化汞表现出了显著雌激素效应，而林丹、氨基脲和三丁基锡没有表现出雌激素效应。这一结果与国内外研究一致，验证了该环境雌激素筛选方法的准确性。根据E2标准曲线回归方程，得到四种污染物的雌激素当量因子，其雌激素效应为：氯化汞＞双酚A＞多氯联苯＞久效磷。
　　(3)环境中不同水体的激素类物质组成复杂，不同的污染物之间可能存在协同、加合和拮抗等多种效应。
　　利用转基因秀丽隐杆线虫RT130品系建立的环境雌激素活体筛选方法可以应用于环境不同水体中雌激素水平的监测，线虫的荧光强度可以表征环境中多种复合污染物的综合雌激素效应：海泊河污水处理厂进水、沉砂池出水、初沉池出水、MSBR(Membrane Sequencing Batch Reactor)处理出水、生物转盘出水和终排水的雌激素当量分别为3.48×10-7g/L、9.36×10-7g/L、3.30×10-7g/L、1.30×10-6g/L、3.67×10-7g/L和3.60×10-6g/L。麦岛污水处理厂进水、沉砂池出水、沉淀池出水和终排水的雌激素当量分别为3.29×10-7g/L、2.73×10-6g/L、2.28×10-5g/L和9.35×10-7g/L。
　　小涧西垃圾填埋场渗滤液(0.5％)、MBR(Membrane Biological Processor)处理后样品(0.5%)和终排水的雌激素当量分别为3.89×10-10g/L、1.95×10-8g/L和3.66×10-8g/L。青岛市第二海水浴场的雌激素当量为5.98×10-12g/L；海泊河入海口海水的雌激素当量为2.16×10-6g/L；墨水河入海口海水的雌激素当量为2.83×10-6g/L；娄山河入海口海水的雌激素当量为9.03×10-9g/L。
　　综上所述，本文利用转基因秀丽隐杆线虫RT130品系初步构建了一个环境雌激素的活体筛选方法，利用该体系可以对单一目标污染物的雌激素水平进行评价，也可以监测环境中多种复合污染物的综合雌激素效应。
　　度可以表征环境中多种复合污染物的综合雌激素效应:
　　海泊河污水处理厂进水、沉砂池出水、初沉池出水、MSBR(Membrane Sequencing Batch Reactor)处理出水、生物转盘出水和终排水的雌激素当量分别为3.48×10-7g/L、9.36×10-7g/L、3.30×10-7g/L、1.30×10-6g/L、3.67×10-7g/L和3.60×10-6g/L。
　　麦岛污水处理厂进水、沉砂池出水、沉淀池出水和终排水的雌激素当量分别为3.29×10-7g/L、2.73×10-6g/L、2.28×10-5g/L和9.35×10-7g/L。
　　小涧西垃圾填埋场渗滤液(0.5%)、MBR(Membrane Biological Processor)处理后样品(0.5%)和终排水的雌激素当量分别为3.89×10-10g/L、1.95×10-8g/L和3.66×10-8g/L。
　　青岛市第二海水浴场的雌激素当量为5.98×10-12g/L;海泊河入海口海水的雌激素当量为2.16×10-6g/L;墨水河入海口海水的雌激素当量为2.83×10-6g/L;娄山河入海口海水的雌激素当量为9.03×10-9g/L。
　　综上所述,本文利用转基因秀丽隐杆线虫RT130品系初步构建了一个环境雌激素的活体筛选方法,利用该体系可以对单一目标污染物的雌激素水平进行评价,也可以监测环境中多种复合污染物的综合雌激素效应。

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0 前言

1 秀丽隐杆线虫在环境内分泌干扰化合物研究中的应用

2 利用转基因秀丽隐杆线虫 RT130 品系建立环境雌激素活体筛选方法

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

3 转基因秀丽隐杆线虫 RT130 品系在单一目标污染物环境雌激素效应活体筛选中的应用

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

4 利用转基因秀丽隐杆线虫 RT130 品系监测环境中多种污染物的环境雌激素综合效应

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

5 结论与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

缩略词表

致谢

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