海参脑苷脂对阿尔茨海默症模型小鼠脑组织相关鞘脂的影响分析

摘要

海参脑苷脂(SCC)是一类结构独特的鞘脂类化合物,具有抗肿瘤、免疫调节、抗菌、心血管保护等作用。目前,其神经保护作用引起关注,并有望开发成为改善老年性脑功能衰退的药物。阿尔茨海默症(Alzheimer‘s disease,AD)是一种原发性退行性疾病,发病原因及机理复杂,发病率逐年增加,已成为不可忽视的社会问题。已有研究表明,鞘脂代谢的异常与AD密切相关。本论文主要利用LC-MS/MS技术,研究SCC对AD小鼠脑组织相关鞘脂含量及分子种的影响,从鞘脂组学方面探究SCC对AD的改善作用。
　　建立了小鼠脑组织中主要鞘脂含量测定的简便准确的正相液相色谱-质谱联用方法(NPLC-MS/MS)。以Agilent RX-SIL柱(2.1 mm×100 mm,1.8μm)为分离柱,氯仿/甲醇/氨水(89.5/10/0.5,v/v)、氯仿/甲醇/水/氨水(55/39/5/0.5, v/v)为流动相,实现了脑苷脂、神经酰胺、硫苷脂、鞘磷脂等4类鞘脂的分离和定量。采用该方法,对正常组、模型组、实验组的鼠脑的海马及皮质的上述鞘脂进行分析。结果表明,模型组相对正常组,其海马和皮质的脑苷脂含量分别下降23.96％和24.23%,神经酰胺含量分别升高67.96%和10.15%,硫苷脂含量分别下降54.82%和23.39%,鞘磷脂含量无明显变化。实验组相对模型组,海马中脑苷脂含量有上升趋势,神经酰胺含量下降32.79%,硫苷脂含量上升45.38%,鞘磷脂无显著性差异。
　　建立了小鼠脑组织中脑苷脂、神经酰胺、硫苷脂分子种分析的反相色谱-质谱联用方法(RPLC-MS/MS)。以Agilent Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm,1.8μm)为分离柱,以甲醇/水(97/3,v/v,含0.5%甲酸和5 mmol/L甲酸)为流动相,实现了对脑苷脂和神经酰胺分子种的分析,以甲醇/异丙醇/水(85/10/5, v/v,含0.5%甲酸和5 mmol/L甲酸)为流动相实现了对硫苷脂分子种的分析。对于脑苷脂、神经酰胺、硫苷脂的定性,除采用质谱子离子扫描和母离子扫描模式外,利用分子种在色谱柱上的保留时间对其结构进行鉴定,大大提高了各分子种结构分析的效率。另外,采用MRM模式,对正常组、模型组、实验组的脑苷脂、硫苷脂、神经酰胺分子种定量,筛选出潜在的鞘脂标志物:羟基化脂肪酸型脑苷脂/非羟基化脂肪酸型脑苷脂(HFA-GalCer/NFA-GalCer)、神经酰胺d18:1-C18:0、硫苷脂 d18:1-C24:1、羟基化脂肪酸型硫苷脂/非羟基化脂肪酸型硫苷脂( HFA-Sulf/NFA-Sulf)、超长链脂肪酸型硫苷脂/长链脂肪酸型硫苷脂( VLFA-Sulf/LFA-Sulf)。模型组相对正常组,海马及皮质的HFA-GalCer/NFA-GalCer分别升高25.13%和14.36%,Cer-d18:1-C18:0分别升高30.63%和10.49%, Sulf-d18:1-C24:1分别降低43.31%和30.26%, HFA-Sulf/NFA-Sulf分别降低34.16%和26.34%,VLFA-Sulf/LFA-Sulf分别降低38.08%和18.33%;实验组相对模型组,海马的各指标变化较明显,其HFA-GalCer/NFA-GalCer降低12.24%, Cer-d18:1-C18:0降低11.81%, Sulf-d18:1-C24:1升高19.39%, HFA-Sulf/NFA-Sulf升高26.34%, VLFA-Sulf/LFA-Sulf升高22.44%。而皮质的各指标基本无显著变化,只有VLFA-Sulf/FA-Sulf升高15.30%。另外对3组样品中的鞘脂分子种进行偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA),发现正常组、模型组、实验组的鼠脑海马中脑苷脂和硫苷脂分子种均可明显区分。
　　建立了小鼠脑组织中葡萄糖脑苷脂定性定量分析的亲水液相色谱-质谱联用方法(HILIC LC-MS/MS)。以Waters Atlantis HILIC Silica(4.6 mm×150 mm,5μm)为分离柱,乙腈/甲醇/水(95/2.5/2.5,v/v,含2%甲酸和2 mmol/L甲酸铵)为流动相,在8 min内实现了葡萄糖脑苷脂的分析。采用MRM模式,对3组小鼠的海马及皮质组织中葡萄糖脑苷脂分析,发现模型组小鼠海马及皮质中的葡萄糖脑苷脂d18:1-C18:0相对正常组小鼠分别提高45.05%和30.41%,半乳糖脑苷脂/葡萄糖脑苷脂(GalCer/GlcCer)的比例分别降低50.68%和21.08%,但实验组相对模型组无显著性差异。

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0.1 海参脑苷脂

0.2 鞘脂概述

0.3 阿尔茨海默症

0.4 本研究的目的与意义

1 海参脑苷脂对AD模型小鼠脑组织鞘脂含量的影响分析

1.1 材料与仪器

1.2 实验方法

1.3 结果与讨论

1.4 本章小结

2 海参脑苷脂对AD模型小鼠脑组织主要鞘脂分子种的影响分析

2.1 材料与仪器

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

3 海参脑苷脂对AD模型小鼠脑组织葡萄糖脑苷脂的影响分析

3.1 材料与仪器

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

4 结论

4.1 总结

4.2 本论文创新点

5 参考文献

6 致谢

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