牙鲆(Paralichthys olivaceus)激活素基因两种β亚基的克隆与表达分析

摘要

Activin(ACT),为激活素,属于转化生长因子β(TGF-β)家族成员,由两个β亚基构成,为一种糖蛋白激素,是作用于下丘脑-垂体-性腺轴的(HPG)关键分子。可以调控垂体类激素的分泌和卵巢中类固醇类激素的产生和卵母细胞的成熟。牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一种重要的经济鱼类,具有生长快等优点。本文克隆了牙鲆ActivinβA和βB亚基的全长序列,并进行了序列特征分析和表达分析。通过染色体步移技术获得ActivinβA和βB亚基启动子序列,并构建了重组原核表达质粒,实现IPTG诱导表达,为进一步研究Activin的生物学功能及为Activin在生产实践上的应用奠定了基础。
　　(1)本研究通过克隆和RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术获得了牙鲆ActivinβA和βB亚基全长cDNA,通过生物软件分别对其进行预测分析,并利用实时荧光定量技术对这些基因在不同组织及发育时期的时空表达进行了研究。
　　A.牙鲆ActivinβA cDNA序列全长1633 bp,ORF为1365 bp,包括30 bp的5′UTR和238 bp的3′UTR。通过软件预测,该基因编码了一个含有454个氨基酸的蛋白质前体,分子量为49.9 kD,等电点为8.26。在该蛋白的N末端包含一个由20个氨基酸残基组成的信号肽。qPCR结果显示,ActivinβA在牙鲆成体的10种组织中均有表达,其中在全脑、鳃和卵巢组织中表达量最高。
　　B.牙鲆ActivinβB cDNA序列全长1783 bp,ORF为1173 bp,包括121 bp的5′UTR和489bp的3′UTR。通过软件预测,该基因编码了一个含有390个氨基酸的蛋白质前体,分子量为43.8 kD,等电点为7.81。在该蛋白的N末端包含一个由22个氨基酸残基组成的信号肽。qPCR结果显示,ActivinβB在牙鲆成体的10种组织中均有表达,其中在卵巢组织中表达量最高。
　　通过软件预测发现牙鲆2种Activinβ亚基都属于分泌型的蛋白,氨基酸序列比对分析表明以上预测出的 Act ivinβ亚基氨基酸序列与其他硬骨鱼类的相似性均较高,显示出硬骨鱼类的Activinβ亚基在进化中的高度保守性。
　　(2)利用染色体步移(Genome walking)的方法克隆了牙鲆Activin基因两个β亚基的上游部分启动子序列,长度分别约为2.7 kb和2.4 kb,并对克隆的启动子序列进行了转录调控元件的生物信息学预测分析。在预测的Act ivinβB转录起始位点(+1位)的上游31 bp处有1个典型的TATA box,而在ActivinβA中未发现TATA box的存在。两个基因的启动子上发现了多个转录因子Sp1、Oct-1、C/EBP、CREB、GATA-1、HNF-3、HNF-1、USF等结合位点,还发现了与内分泌相关的Pit-1、ER、PR、GR、RAR、RXR等结合位点,但肌性转录因子MyoD、myogenin和雄性的性别决定基因SRY结合位点仅在ActivinβA启动子中发现。生物信息学分析显示,牙鲆Act ivinβA和βB表达受到多种潜在因子的调控,两者在调控上有所差异。
　　(3)构建了牙鲆ActivinβA和βB的大肠杆菌表达系统:以pET32a(+)为表达质粒,将ActivinβA和βB cDNA序列(去掉编码信号肽部分的序列)插入其中构建了重组质粒,并在BL21(DE3)pLysS中得到了高水平表达。为进一步从分子水平研究Act ivin的功能奠定了基础。

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第一章 文献综述

1 Activin的研究进展

2 Activin和Inhibin近期新的研究发现

第二章 牙鲆Activin基因βA亚基的克隆、表达分析和原核表达

第一节 牙鲆Activin基因βA亚基的克隆、表达分析

1材料和方法

2 结果

第二节 牙鲆ActivinβA基因的原核表达

1材料和方法

2结果

3讨论

第三章 牙鲆Activin基因βB亚基的克隆、表达分析和原核表达

1材料和方法

2结果

第二节 牙鲆ActivinβB基因的原核表达

1材料和方法

2结果

3讨论

第四章 牙鲆ActivinβA和βB启动子序列的克隆和生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

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