斑马鱼rspo1和rspo3基因体内功能和作用机制的研究

摘要

Wnt信号通路是生物体最重要最基础的调控途径之一，它直接参与细胞增殖、细胞命运决定、细胞极性调控，以及形态形成等过程。Wnt信号通路的异常调节会导致多种病理过程，包括多种癌症。Wnt信号通路根据下游途径大致分为依赖于β-Catenin的经典Wnt信号通路，即Wnt/β-catenin信号通路，和不依赖于β-Catenin的非经典Wnt信号通路，如Wnt/PCP信号通路。在胚胎早期发育中，受精后不久Wnt信号通路成员便开始参与调控生物体多个过程，其中包括重要的体轴建立和原肠胚运动。
　　RSPOs/Rspos家族是一类分泌蛋白，最早作为经典Wnt信号通路激活因子被发现。在哺乳动物以及两栖类中的研究揭示了家族成员重要的生物学功能，但其作用机制还存有争议，此外在鱼类中的家族成员组成、结构特点及功能还了解较少。本研究以斑马鱼为模型，开展了斑马鱼rspo1和rspo3基因在早期胚胎发育中的功能研究。
　　对rspo3基因的研究发现，斑马鱼Rspo3有三个furin-like(FU)结构域，这与哺乳动物和两栖类中的同源蛋白的两个FU结构域组成不同，且这一结构特点在所检测的辐鳍鱼类都存在，而软骨鱼类象鲨也只有两个FU结构域。斑马鱼rspo3为母源基因，在胚胎早期呈全身性表达。12 hpf后表达出现组织特异性。过表达rspo3促进前端及背部组织发育，增加背部及前端标记基因的表达。敲降rspo3造成胚胎腹部后端化，并促进腹部和后端标记基因的表达。通过对母源Wnt/β-catenin靶基因的检测发现，过表达rspo3对母源Wnt信号通路没有影响，而敲降rspo3有促进母源经典Wnt信号通路的趋势。进一步检测Rspo3对合子型Wnt/β-catenin的作用发现，过表达rspo3抑制内源及外源Wnt3a配体诱导的经典Wnt信号通路的活性;敲降rspo3则相反地激活经典Wnt信号通路。对神经外胚层标记基因检测表明，Rspo3抑制合子型经典Wnt信号通路，表现为过表达rspo3促进前端神经外胚层的发育，抑制后端组织的发育;而敲降rspo3有相反的作用。以上结果确证了斑马鱼Rspo3在胚胎早期发育中负调控经典Wnt/β-catenin信号通路，并促进背部和前端组织发育。随后对其作用机制进行研究。首先通过与不同作用层次的经典Wnt信号通路激活因子的遗传互作检测发现，斑马鱼Rspo3抑制经典Wnt信号通路作用于膜受体Lrp6下游，胞内β-Catenin蛋白降解复合体上游。进一步与Lrp6C-Cav1a的共注射发现，Rspo3不能营救回融合蛋白对Wnt信号通路的激活作用，初步提示了Rspo3与Lrp6信号分子内化的关系。随后在斑马鱼胚胎中进行免疫共沉淀实验，证实了这一推测。激活的Lrp6信号与Caveolin1a结合，依赖于Caveolin1a介导的内化向胞内传递信号。而共注射rspo3能减少Lrp6与Caveolin1a的结合，因此阻碍Wnt信号的转导，发挥拮抗经典Wnt信号通路的作用。将人RSPO3基因与斑马鱼rspo3基因进行功能比较发现，过表达RSPO3同样促进背部组织发育，抑制腹部组织形成，表明在斑马鱼胚胎中RSPO3/Rspo3蛋白功能的保守性。
　　对斑马鱼rspo1基因在胚胎早期发育中的功能研究发现，斑马鱼Rspo1通过抑制非经典Wnt/PCP信号通路调控胚胎汇聚延伸运动。首先对其结构域分析发现，斑马鱼Rspo1含有典型的RSPOs/Rspos结构域，包含一个SP结构域，两个FU结构域，一个TSP1结构域。斑马鱼rspo1呈母源表达，且在0-4 hpf表达量较高;早期胚胎中呈全身性表达模式。过表达和敲降实验发现，异常表达的rspo1都会影响胚胎的汇聚延伸运动，表现为明显的12 hpf时期胚胎前后端夹角变大。功能结构域研究表明FU结构域是Rspo1发挥调控胚胎发育作用的关键结构域。进一步对胚胎背腹发育的检测表明，敲降rspo1不影响胚胎早期背腹的分化，表明Rspo1不是通过影响背腹发育进而影响调控汇聚延伸运动的。标记基因的原位杂交检测也再次证实了敲降rspo1对胚胎汇聚延伸运动的影响。通过对非经典Wnt/PCP信号通路报告质粒活性的检测发现，在斑马鱼胚胎中，过表达rspo1抑制Wnt/PCP信号通路活性，且呈剂量依赖性;而敲降rspo1相反地能激活Wnt/PCP信号通路。斑马鱼胚胎中敲降rspo1能上调JNK2的磷酸化水平，也进一步直接表明敲降rspo1促进非经典Wnt/PCP信号通路活性。最后在斑马鱼胚胎中检测Rspo1与非经典Wnt信号通路配体的功能相互作用。低剂量的Wnt配体的mRNA和低剂量敲降rspo1对胚胎发育都没有明显影响，但当两者共同处理时，能协同激活非经典Wnt信号通路，显著地影响胚胎汇聚延伸运动，造成胚胎发育缺陷。结果表明在斑马鱼胚胎中Rspo1参与并负调控非经典Wnt信号通路，进而影响胚胎汇聚延伸运动。
　　本研究对斑马鱼rspo3基因进行全面研究，首次揭示了在脊椎动物体内Rspo3通过拮抗经典Wnt/β-catenin信号通路调控胚胎早期背腹及前后端发育的功能。对斑马鱼rspo1基因在早期胚胎发育中的功能研究，首次揭示了Rspo1参与负调控非经典Wnt/PCP信号通路并影响胚胎汇聚延伸运动的作用。这些结果加深和拓展了对RSPOs/Rspos家族的认识;为对其的功能研究提供了新的思路和方向;同时也为以其为靶点的临床疾病治疗提供了更多依据。