褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)Trxl,TRP14和Prxl基因的克隆、表达和转录水平的免疫刺激反应

摘要

褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）是一种非常珍贵的经济鱼类，随着养殖规模的扩大化，养殖中面临的鱼类疾病感染问题愈发严峻。为了更好地找到解决问题的办法，了解鱼类的免疫机制是很必要的。本文主要是研究了三个褐牙鲆抗氧化相关基因硫氧还蛋白1基因（thioredoxin1，PoTrx1)、硫氧还蛋白相关蛋白14（thioredoxin related protein14，PoTRP14）和过氧化物酶基因1（Peroxidase1，PoPrx1）基因的基因序列信息和各组织、不同发育时期的表达差异，以及在接受免疫刺激的条件下，表达模式会有何变化。本研究采用RACE(Rapid amplificationof cDNA ends，RACE)技术克隆得到PoTrx1、PoTRP14基因的cDNA全长，并运用各种生物信息学软件对序列信息进行分析和预测，预测了所编码相关蛋白的基本信息、进行了物种间同源性的分析，并构建了各物种间的进化树。RT-PCR法分析了PoTrx1、PoTRP14基因在成体鱼八个不同组织和十四个不同胚胎发育时期的表达差异。同时建立了褐牙鲆肝脏细胞原代培养系统，分别用LPS、CuSO4和H2O2刺激肝脏细胞，然后用RT-PCR法分析免疫刺激前后PoTrx1、PoTRP14和PoPrx1基因的表达模式有何变化。研究成果作如下分述:
　　1、PoTrx1基因全长cDNA的克隆和表达分析
　　运用RACE技术克隆得到PoTrx1基因cDNA全长为723bp，其中包括366bp的开放阅读框(ORF)、324bp的3'-UTR和33bp的5'-UTR。预测该基因可编码121个氨基酸，理论分子量为15.90kDa，理论等电点为5.39。ORF中具有Trx1基因典型的保守区CGPC。同时分析了Trx1在不同物种之间的相似性，其中PoTrx1同半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）、条石鲷（Oplegnathus fasciatus）和松江鲈（Trachidermus fasciatus）的一致度分别为:60％、67％和61％。RT-PCR法检测显示PoTrx1在成体鱼八个组织中都有表达，尤其在小肠中的表达量最高，其次为肾脏、心脏、肝脏、脑和鳃，在肌肉组织中的表达量最低。组织表达的差异中，PoTrx1基因在免疫相关器官中的表达较高，这与Trx1执行的免疫功能相关。同时检测了PoTrx1基因在14个胚胎不同发育时期的表达情况，各发育时期的表达量有显著的差异，PoTrx1在未受精卵时期就已经开始表达，然而从1细胞期开始直到囊胚期的表达量都是相对稳定的低表达量，从神经胚期开始，表达量剧增，在体节期达到高峰，出膜期以及出膜一天表达量开始下降。建立褐牙鲆肝脏细胞原代培养系统，选用LPS、CuSO4和H2O2三组刺激物刺激肝脏细胞，PoTrx1的表达出现了显著的上调。LPS刺激之后，6h之后达到一个表达的高峰，随后在24h之后又出现的新的表达高峰;CuSO4刺激之后2h后迅速达到高峰，随后降低，维持一个较低的表达水平，在48h又出现了新的表达高峰;H2O2刺激组则是在12h和24h出现了明显的表达高峰。免疫刺激之后，PoTrx1表达量的上调说明Trx1基因功能同机体的免疫和抗氧化密不可分。
　　2、PoTRP14基因全长cDNA的克隆和表达分析
　　PoTRP14基因cDNA序列全长为909bp，其中包括58bp的5'-UTR区和479bp的3'-UTR区，预测372bp的ORF区可编码123个氨基酸，理论分子量和理论等电点分别为14.01kDa和5.70。ORF区具有TRP14基因共有的CPDC保守序列。PoTRP14同裸盖鱼（Anoplopoma fimbria）、大西洋鲑（Salmo salar）和点带石斑鱼（Epinephelus coioides）的一致度均为87％，同松江鲈(Trachidermus fasciatus)的一致度为86％。经RT-PCR检测分析，PoTRP14在各组织中都有表达，小肠中的表达量最高，其次为肾脏、心脏、肝脏、脑和鳃，在脾脏组织中的表达量最低。Po TRP14基因在不同胚胎发育时期的表达总体维持着较高的表达量，在未受精卵中有较高的表达量，随后的几个时期表达量相对稳定，高囊胚期相对低，在出膜前表达量出现一个急剧增长的表达高峰，随后急剧下降。PoTRP14基因在免疫刺激后肝脏细胞中的表达亦出现明显的上调，PoTRP14基因在LPS刺激后的6h和48h分别出现表达高峰;CuSO4刺激的2h和48h出现表达高峰，明显高于其他实验组;H2O2刺激后的12h和48h有表达高峰。
　　3、PoPrx1基因全长cDNA的克隆和表达分析
　　在免疫刺激实验中，PoPrx1基因的表达变化总体上是上调趋势。LPS刺激肝脏细胞后，PoPrx1基因的表达在6h和24h分别出现表达高峰;CuSO4刺激之后，2h和48h出现表达高峰;H2O2刺激组则是在12h和48h有表达高峰。本文所研究的三个抗氧化相关基因PoPrx1和PoTrx1、PoTRP14表达模式变化趋势大同小异，说明这三个基因在执行免疫防御功能和抗氧化机制上具有相似的特点。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

第一节 鱼类免疫系统研究概述

第二节 鱼类抗氧化机制研究概述

第三节 硫氧还蛋白基因研究进展

1．3．1 硫氧还蛋白的研究进展

1．3．2 硫氧还蛋白基因家族的生物学功能

第四节 硫氧还蛋白相关蛋白TRP14的研究进展

第五节 硫氧还蛋白过氧化物酶Prx的研究进展

第六节 鱼类细胞培养研究进展

第七节 本论文研究的方法、意义

1．7．1 本研究的方法

1．7．2 本研究的意义

第二章 PoTrx1和PoTRP14基因的克隆

2．1 引言

2．2 材料方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验中的引物

2．2．3 总RNA的提取和纯化

2．2．4 cDNA第一链的合成

2．2．5 PoTrx1基因和PoTRP14基因核心片段的获得

2．2．6 PoTrx1基因和PoTRP14基因3’UTR片段的获得

2．2．7 PoTrx1基因和PoTRP14基因5’UTR片段的获得

2．2．8 PoTrx1基因和PoTRP14基因的序列分析、同源比对和进化树构建

2．3 实验结果

2．3．1 总RNA的提取

2．3．2 PoTrx1和PoTRP14基因全长cDNA序列的获得

2．3．3 PoTrx1和PoTRP14基因同源性分析

2．3．4 PoTrx1和PoTRP14基因进化树的构建

2．4 讨论

第三章 PoTrx1和PoTRP14基因表达分析

3．1 引言

3．2 实验方法

3．2．1 cDNA制备

3．2．2 实时荧光定量Real-time PCR

3．2．3 免疫刺激后PoTrx1基因和PoTRP14基因的表达模式

3．3 实验结果

3．3．1 PoTrx1的组织差异性表达

3．3．2 PoTRP14的组织差异性表达

3．3．3 PoTrx1不同发育时期表达差异

3．3．4 PoTRP14不同发育时期表达差异

3．3．5 免疫刺激前后PoTrx1基因的表达模式

3．3．6 免疫刺激前后PoTRP14基因的表达模式

3．4 讨论

第四章 PoTrx1基因免疫刺激后表达模式

4．1 引言

4．2 实验方法

4．2．1 mRNA的提取和反转录

4．2．2 LPS、CuSO4和H2O2刺激褐牙鲆肝脏细胞后PoTrx1基因表达模式

4．3 实验结果

4．4 讨论

参考文献

致谢

个人简历

在学期间发表的学术论文与研究成果