液相质谱新技术和新方法在糖胺聚糖分析中的应用研究

摘要

糖胺聚糖(GAGs)是一类由重复二糖结构单元组成的长链大分子，在一系列生理过程如抗凝血、生长发育、血管生成、癌症演变等中起着重要的作用。研究在生理病理变化过程中，细胞、组织和体液等生物样本中GAGs组成和结构的变化，有利于探明其发生发展或病变的机制。而天然的多糖是重要的生物活性物质和药物的来源，几种GAGs衍生物药物已经临床应用。近年来，海洋生物中GAGs类的硫酸多糖由于其特殊的生理功能和潜在的药用价值越来越被研究者所关注。但是这些天然多糖的分子量大且聚合度分散，完整的GAGs分子很难进行直接分析，需要特定的化学降解或酶解过程。因此，目前微量生物样品中GAGs的高通量痕量分析、开发和建立新的寡糖制备方法以及解码其复杂结构序列的新方法均是目前亟待解决的科学问题。
　　本文依据先进的液相色谱质谱联用技术，建立适用于GAGs研究的方法和策略，主要包括亲水作用色谱(HILIC)与高分辨傅里叶变换质谱(FT-MS)联用，应用于GAGs的定性或定量分析;并建立基于质谱多反应监测技术(MRM)的LC-MSMS高通量痕量分析微量生物样本中GAGs方法，进而拓展这些方法在生物样品中的应用。
　　首先，基于在线HILIC-FTMS分析结合糖生物信息化处理数据建立了快速、准确、全面鉴别抗凝血药物低分子量肝素(LMWHs)的Bottom-up方法。该方法度灵敏高，可检测低至0.01％的寡糖组分。色谱分析可在7 min内完成，而糖生物信息化数据处理简化了处理过程，极大的缩短了分析时间。基于本方法，对三种来自不同生产商的LMWHs中主要的不饱和寡糖、含有3-O-硫酸基的四糖、1，6-酐衍生物、非还原端的寡糖以及连接域寡糖等40多个组分的定量分析。该方法可以作为LMWHs的高通量分析方法，用于LMWHs生产过程中的质量控制。
　　基于上述分析方法及建立的自由基降解GAGs的微反应体系，对肝素、硫酸软骨素A、N-硫酸化-heparosan、过硫酸化硫酸软骨素(OSCS)等四种不同类型的GAGs进行了轮廓分析，并研究了不同GAGs寡糖在HILIC色谱柱上的保留特性。将以上策略应用于研究不能被特异性酶解、结构特殊的GAGs海参岩藻糖基化的硫酸软骨素(SC-FCS)的轮廓分析。此外，还针对肝素中三种可能存在过硫酸化的GAGs污染物(OSCS、过硫酸化硫酸乙酰肝素(OSHS)和N-硫酸化OSCS(NSOSCS))因结构相似而难以鉴别的问题，通过自由基降解体系，以降解后产生的特异性二糖或三糖组分作为诊断离子，建立了HILIC-FTMS鉴别和定量分析肝素中复杂污染物的方法。通过本方法明确了2008年肝素污染事件中主要的污染物为OSCS，同时能够检测一种新型潜在的肝素污染物NSOSCS。
　　内源性的糖胺聚糖与许多重大疾病的发病机制相关。本文采用LC-MS分析方法研究了不同致病机制的呼吸衰竭病人血浆中GAGs的变化。在意识不清、间接性肺损伤和直接性肺损伤病人的血浆中CS的浓度未表现出明显性变化，但是组成上，相对于健康对照组，CS-4S含量显著降低，而CS-OS含量显著增加。败血症、胰腺炎等间接性肺损伤病人血浆中HS-GAGs的浓度和硫酸化程度均显著性升高;并在败血症患者血浆中发现一个平均分子量为1.25KDa的特征性HS-GAGs寡糖组分;而胰腺炎病人病情变化过程中血浆HS-GAGs的浓度和硫酸化程度会随着病情的好转而降低，所以HS-GAGs可以作为败血症、胰腺炎等间接性肺损伤疾病的血液学标志物。直接性肺损伤的肺炎病人血浆中HA的浓度比健康对照组增加了31.53倍(p＜0.05)，其可以作为肺炎诊断的标志物。呼吸衰竭病人的致病机制不同，血浆中GAGs变化也存在特异性，说明在发病过程中GAGs的作用有差异，为疾病的治疗提供指导和方向。
　　在上述研究基础上，针对微量生物样本中GAGs分析繁琐、难以检测的问题，建立了一种快速灵敏的微量生物样品中GAGs的痕量分析方法。首先，提出了一种新的细胞中GAGs二糖富集的方法，与传统方法相比，其样品处理时间由原来的1～2周缩短为1～2天;其次，建立了以LC-MSMS-MRM技术同时分析17种GAGs二糖的方法，分析的LOD为0.16～1.3pg，较现有的分析方法灵敏度提高了500多倍。在此基础上，应用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞作为模型用于上述分析体系评价，结果显示只需5000～10000个细胞便可定量分析其中所有的二糖组分，而在500个细胞时便可检测到主要的二糖。并进一步利用该体系高通量测定了20株不同的人源细胞株中GAGs组学，丰富了这些细胞株的糖组学信息，并探讨了它们的生物学特性和GAGs组学间的关系。该方法为数目较少或者难以富集的生物样品中GAGs组学研究提供了有效的分析方法。

目录

声明

本文所用主要缩略语

摘要

前言

1 糖胺聚糖的种类、合成及其生物学功能

1．1 肝素和硫酸乙酰肝素

1．2 硫酸软骨素和硫酸皮肤素

1．3 透明质酸

1．4 硫酸角质素

2 糖胺聚糖的提取及分离纯化

3 糖胺聚糖的解聚

4 糖胺聚糖的分析技术

4．1 液相色谱技术

4．2 电泳技术

4．3 核磁共振波谱技术

4．4 质谱技术

4．5 液相色谱-质谱联用技术在GAGs研究中的应用进展

4．6 糖生物质谱的信息化分析

5 海洋源GAGs及其结构类似物研究进展

6 本文的立体依据、内容及意义

参考文献

第1部分 亲水作用色谱和傅里叶变换质谱联用技术在糖胺聚糖研究中的应用

第一章 基于Bottom up方法HILIC-FTMS高通量分析低分子量肝素精细结构

1 材料和仪器

2 实验方法

3 结果与讨论

4 小结

参考文献

第二章 自由基降解结合HILIC-FTMS在糖胺聚糖研究中的应用

第一节 不同类型糖胺聚糖自由基降解产物HILIC-FTMS分析

第二节 自由基降解结合HILIC-FTMS鉴别和测定肝素中过硫酸化糖胺聚糖污染物

参考文献

第2部分 基于液质联用技术的微量生物样品中糖胺聚糖组学研究

第三章 血浆糖胺聚糖作为疾病生物标记物的应用研究

1 材料与仪器

2 实验方法

3 结果和讨论

4 小结

参考文献

第四章 微量生物样品中糖胺聚糖高通量痕量分析方法的建立及其应用

1 试剂与仪器

2 实验方法

3 结果与讨论

4 小结

参考文献

总结与展望

创新点

附录

个人简历

发表的学术论文与研究成果

致谢