南极乔治王岛陆地和潮间带放线菌多样性研究

摘要

南极乔治王岛位于南极洲的低纬地区，因处在南极半岛与南美大陆间的多气旋地带，具有复杂多变的气候环境特征，生态环境和生物群落对区域性或全球性气候环境变化具有敏感性，是研究南极陆地和近岸海域生态系统的理想场所。作为微生物的一大类群，南极环境中的放线菌在长期适应这一特殊地理环境的过程中，可能会形成独特的适应模式以及分子调节机制，从而产生物种的新颖性和多样性，其所蕴含的应用潜力巨大，受到国内外微生物研究学者的高度重视。本文利用PCR-DGGE技术、16S rDNA克隆文库技术和纯培养技术对南极乔治王岛陆地土壤和潮间带底泥放线菌的多样性进行了研究，为有效开发利用特有南极放线菌资源奠定基础。
　　首先利用PCR-DGGE技术对南极乔治王岛陆地土壤和潮间带底泥共12个样品中放线菌的多样性和群落结构组成进行初步研究。从DGGE图谱中条带的多少及条带测序结果可以看出南极乔治王岛陆地土壤和潮间带底泥中蕴含丰富的放线菌资源，其中陆地土壤样品中放线菌的多样性要高于潮间带底泥样品中放线菌的多样性。测序结果显示，陆地土壤样品中的30个条带分布于放线菌纲(Actinobacteria)、酸微菌纲(Acidimicrobiia)和红椿杆菌纲(Coriobacteriia)3个纲中的10个目、15个科中，其中放线菌纲中的假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)的条带数最多，是该区域的优势菌群;潮间带底泥样品中的14个条带分布于放线菌纲和酸微菌纲2个纲中的5个目、5个科中，放线菌纲中的去甲基醌菌科(Demequinaceae)数量最多，为优势菌群。
　　构建了4个放线菌16S rDNA克隆文库，对这12个样品中放线菌的多样性及群落结构做进一步分析。16S rDNA序列的测序结果表明，南极乔治王岛陆地土壤和潮间带底泥环境中蕴涵着丰富且多样的放线菌资源，而且陆地土壤中放线菌的多样性要高于潮间带底泥中放线菌的多样性。两个陆地土壤样品的16SrDNA克隆文库陆2和陆4中获得的放线菌均分布于放线菌纲和酸微菌纲的10个目、16个科中，这6个陆地土壤样品中共包含了10个目、19个科，其中放线菌纲占优势;潮间带底泥样品的2个16S rDNA克隆文库中放线菌的多样性相对较低，分布于放线菌纲和酸微菌纲的8个目、14个科中，其中E5和E8混合样品中获得的放线菌分布于5个目、8个科中;E1、E11、W3和W4混合样品中的放线菌分布于7个目、13个科中，这2个文库中均是酸微菌纲占优势。将不同分类单元的代表序列与最大已知同源性序列构建N-J系统发育进化树，发现很多序列形成独立的分支，与已知的同源性最大的菌株序列遗传距离较远，表明南极乔治王岛陆地和潮间带环境中蕴藏着大量的放线菌新类群。
　　利用11种不同的培养基对南极乔治王岛陆地土壤和潮间带底泥共30个样品进行放线菌的分离纯化，共分离得到234株放线菌，经过表观排重后选取代表菌株进行16S rDNA全长序列测定并进行Blast比对，结果显示这些菌株分别属于放线菌纲的5个目，共9个属25个不同的种，以Streptomyces、Arthrobacter和Nocardiopsis属菌株居多，其余均为稀有菌属: Tsukamurella、Nesterenkonia、Pseudonocardia、Microbacterium、Kocuria和Mircrococcus，其中从陆地土壤17个样品中分离得到的143株放线菌属于放线菌纲的7个属、17个种;潮间带底泥13个样品中分离得到的91株放线菌属于放线菌纲的5个属、10个种。纯培养结果再次表明南极乔治王岛陆地和潮间带环境中蕴藏着丰富的放线菌资源，陆地土壤中放线菌的多样性要高于潮间带底泥中放线菌的多样性。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 放线菌概述及研究意义

1．1．1 放线菌概述

1．1．2 放线菌研究的意义

1．2 南极地区放线菌研究概况及研究意义

1．2．1 南极及南极乔治王岛概述

1．2．2 极地放线菌研究概况

1．3 微生物多样性研究技术

1．3．1 传统的研究方法

1．3．2 分子生物学方法

1．4 本论文研究的目的及意义

第二章 DGGE技术分析南极乔治王岛陆地和潮间带放线菌多样性

2．1 实验材料

2．1．1 样品

2．1．2 主要试剂和仪器

2．2 实验方法

2．2．1 样品总DNA的提取(强力土壤DNA提取试剂盒)

2．2．2 放线菌门特异性引物扩增及纯化

2．2．3 V3高变区特异性引物扩增

2．2．3 DGGE电泳、切胶回收、扩增并克隆测序

2．3 实验结果与分析

2．3．1 引物的选择及阳性对照的设计

2．3．2 样品总DNA的提取

2．3．3 放线菌门特异性引物扩增

2．3．4 V3高变区特异性引物扩增

2．3．5 DGGE电泳、切胶回收、扩增并克隆测序

2．3．6 DGGE技术分析南极乔治王岛陆地和潮间带放线菌多样性

2．3．7 南极乔治王岛陆地和潮间带样品中放线菌多样性比较及分析

2．4 本章小结

第三章 16S rDNA文库技术分析南极乔治王岛陆地和潮间带放线菌多样性

3．1 实验材料

3．1．1 样品

3．1．2 主要试剂和仪器

3．2 实验方法

3．2．1 样品总DNA的提取

3．2．2 放线菌门特异性引物扩增及纯化

3．2．3 16S rDNA序列的克隆与测序

3．2．4 16S rDNA克隆文库的系统发育及多样性分析

3．3 实验结果与分析

3．3．1 样品总DNA的提取

3．3．2 放线菌门特异性引物扩增

3．3．3 16S rDNA克隆文库的构建及RFLP分析

3．3．4 16S rDNA克隆文库的多样性指数分析及稀有度曲线

3．3．5 16S rDNA克隆文库的多样性及系统发育分析

3．3．6 南极乔治王岛陆地和潮间带样品中放线菌多样性比较及分析

3．5 本章小结

第四章 纯培养技术分析南极乔治王岛陆地和潮间带放线菌多样性

4．1 实验材料

4．1．1 样品

4．1．2 主要试剂和仪器

4．1．3 培养基

4．1．4 主要引物

4．2 实验方法

4．2．1 放线菌的分离培养

4．2．2 菌株的纯化及保藏

4．2．3 放线菌菌株基因组DNA的提取

4．2．4 菌株16S rDNA的扩增

4．2．5 PCR扩增产物的纯化

4．2．6 序列的克隆及测序

4．3 实验结果

4．3．1 南极乔治王岛陆地土壤和潮间带底泥样品放线菌的分离纯化

4．3．2 放线菌菌株基因组DNA的提取

4．3．3 南极乔治王岛陆地和潮间带放线菌菌株16S rDNA的扩增

4．3．4 南极乔治王岛陆地土壤和潮间带底泥样品中放线菌菌株多样性分析

4．3．5 16S rDNA系统发育树的构建与分析

4．4 免培养与纯培养分析放线菌多样性比较

4．5 本章小结

论文总结

研究展望

参考文献

致谢

个人简历

发表的学术论文