基于菲律宾蛤仔的近海多环芳烃生物监测技术的研究

摘要

多环芳烃(PAHs)是持久性有机污染物(POPs)的一种，分子中含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物，多数具有“三致”效应，即致癌性、致畸性和致突变性，可通过生物累积及食物链传递给海洋生物，给生态环境和人体健康带来极大危害，目前已引起各国环境科学家的极大重视。2011年欧盟委员会发布Regulation(EC) No835/2011法规提出以苯并(a)芘(BaP)、苯并(a)蒽(BaA)、苯并(β)荧蒽(BbF)和屈(Chr)4种多环芳烃总含量作为食品中PAHs限量的新评价标准。本论文选择我国沿海重要经济贝类菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）为研究对象，利用数字基因表达谱和基因克隆表达分析研究了菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下解毒代谢的分子机制;研究了PAHs对菲律宾蛤仔不同组织累积含量、解毒代谢酶和相关基因以及损伤效应的影响，初步探讨了PAHs在菲律宾蛤仔体内蓄积规律和毒性效应，筛选基于菲律宾蛤仔的用于海洋PAHs污染评价的生物标志物;并且通过对胶州湾、莱州湾近海养殖水环境PAHs的含量分析以及基于菲律宾蛤仔的双壳贝类PAHs生物监测分析，验证了生物标志物的有效性，也为评价PAHs对海洋生物毒性效应、保障水产品质量安全和监测海洋环境PAHs污染提供理论基础。
　　1、菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下解毒代谢分子机制的研究
　　本章首先利用数字基因表达谱(DGE)技术分析了BaP（1μg/L）胁迫15天时菲律宾蛤仔消化盲囊组织差异基因表达情况，对照组和染毒组分别获得了10508312和11414297条clean reads，将clean reads上传至NCBI SRA文库(accession number:SRP034889);将clean reads与本实验室已完成拼接的菲律宾蛤仔转录组文库unigene进行拼接比对，比对率分别为53.27％和52.22％;通过DGE序列比对分析，共筛得差异表达基因145条，其中上调基因58条，下调基因87条;经GO功能聚类分析以及KEGG通路分析显示，差异基因主要涉及机体生长发育、抗氧化代谢、细胞凋亡以及解毒代谢机制;运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术，选取5条差异表达关键基因（热激蛋白22、谷胱甘肽过氧化物酶、Mantle gene6、皮连蛋白3、假定蛋白）以及8条非差异表达解毒代谢关键基因（芳烃受体、热激蛋白90、热激蛋白70、环氧化物水解酶、二氢二醇脱氢酶、磺基转移酶、谷胱甘肽S转移酶、超氧化物歧化酶）验证了DGE结果可靠性。
　　通过RACE和RT-PCR技术获得菲律宾蛤仔热激蛋白70(HSP70)、热激蛋白90(HSP90)基因的cDNA全长序列，其中HSP70全长2336 bp(GenBank Accession Number:KJ569079)，HSP90全长2839 bp(GenBank Accession Number:KJ569080);序列分析表明HSP70基因含有51 bp的5'端非编码区、335 bp的3'端非编码区和1950 bp的开放阅读框，开放阅读框编码650个氨基酸;HSP90基因含有107bp的5'端非编码区、554 bp的3'端非编码区和2178 bp的开放阅读框，开放阅读框编码726个氨基酸;同源性分析显示2种基因的蛋白序列与其它双壳贝类的HSP具有较高的同源性;系统进化树分析发现，两者均与其它双壳贝类亲缘关系最近，与虾蟹等节肢动物次之，而与硬骨鱼类和高等脊椎动物亲缘关系较远;组织特异性分析发现HSP70与HSP90在菲律宾蛤仔消化盲囊、鳃、闭壳肌和外套膜中均有表达，两者均在消化盲囊和鳃中表达量较高;并且通过qRT-PCR技术初步研究了HSP70和HSP90在菲律宾蛤仔PAHs解毒代谢中的功能。
　　2、菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下生物标志物筛选技术的研究
　　本章以菲律宾蛤仔为研究对象，将其暴露于PAHs(混合比例BaP∶ BbF∶ Chr∶ BaA=1∶1∶1∶1;染毒梯度:0、0.05、0.5、5μg/L)21d，分别于0、1、3、6、10、15、21d取样，之后停止染毒，进行PAHs消除实验，分别于22、24、27、31、36d取样，取样组织为鳃、消化盲囊、闭壳肌。测定了PAHs在4种组织中的累积含量，研究了PAHs在菲律宾蛤仔体内的蓄积特征与消除规律，结果表明，各处理组不同组织中PAHs的累积含量在染毒实验时间内呈逐渐升高趋势，呈现时间-剂量效应，在同一染毒浓度下，相同组织中4种PAHs累积含量的顺序基本为Chr＞BaA＞BaP＞BbF;不同组织中PAHs蓄积含量的顺序基本为消化盲囊＞鳃＞软体部＞闭壳肌。消除实验开始后，PAHs的累积含量显著下降，基本在31d趋于稳定，实验结束后中、高浓度PAHs处理组中PAHs累积含量仍然显著高于对照组。整个实验过程中，对照组无显著变化。
　　为了研究PAHs在菲律宾蛤仔体内的毒性效应，取染毒和消除实验中的鳃和消化盲囊组织，测定了以下几种解毒代谢酶及相关基因(i)Ⅰ相解毒代谢酶(AHH、DD、EH)和Ⅱ相解毒代谢酶(GST、UGT、SULT);(ii)抗氧化防御酶相关指标(总抗氧化能力、SOD、GSH/GSSG);(iii)生物大分子损伤（DNA链断裂、蛋白羰基化、脂质过氧化）解毒代谢关键基因表达（PgP、AhR、HSP90、ARNT、EH、DD、GST、SULT、SOD）。结果表明，不同浓度处理组鳃和消化盲囊组织中所有指标均被不同程度诱导，都具有明显的时间-剂量效应，其中消化盲囊组织比鳃变化明显。依据PAHs累积含量与不同指标之间的相关性分析，选取相应的指标作为评价海洋PAHs污染的生物标志物。
　　3、基于菲律宾蛤仔的胶州湾、莱州湾PAHs生物监测技术的研究
　　胶州湾（红岛、营海）、莱州湾（广利港、下营港）近海不同季度现场取样（3月、6月、9月、12月）结果表明，胶州湾营海站点的表层海水与沉积物中PAHs污染较严重，而莱州湾广利港的PAHs污染情况要比下营港严重;各站点中6月和9月的PAHs污染情况较严重;菲律宾蛤仔消化盲囊中AHH、GST和SOD酶活力、DNA碱解旋、HSP90、DD和GST的mRNA基因表达与PAHs含量具有较好的一致性，为筛选胶州湾、莱州湾PAHs污染监测的有效生物标志物提供了理论依据。

目录

声明

摘要

前言

第一章 文献综述

1 海洋PAHs的污染现状

1．1 PAHs的来源与危害

1．2 海洋环境中PAHs的污染现状

2 PAHs对贝类毒性机制的研究进展

2．1 PAHs在生物体内解毒代谢机制的研究进展

2．2 PAHs对生物体解毒代谢信号转导机制的研究进展

3 海洋PAHs监测技术的研究进展

3．1 化学监测

3．2 生物监测

4 论文立体依据、研究内容和意义

第二章 菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下解毒代谢分子机制的研究

第一节 菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下基因表达谱的高通量分析

1 材料方法

2 实验结果

3 讨论

第二节 菲律宾蛤仔HSP70、HSP90基因全长克隆与表达分析

1 材料方法

2 实验结果

3 讨论

第三章 菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下生物标志物筛选技术的研究

第一节 菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下体内累积特征和消除规律的研究

1 材料方法

2 实验结果

3 讨论

第二节 菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下解毒代谢途径的研究

1 材料方法

2 实验结果

3 讨论

第三节 菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下抗氧化防御系统响应机制的研究

1 材料方法

2 实验结果

3 讨论

第四节 菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下生物大分子损伤机制的研究

1 材料方法

2 实验结果

3 讨论

第五节 菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下生物标志物筛选的研究

1 材料方法

2 实验结果

3 讨论

第四章 基于菲律宾蛤仔的胶州湾、莱州湾PAHs生物监测技术的研究

第一节 胶州湾、莱州湾近海养殖水环境PAHs含量的研究

1 材料方法

2 实验结果

3 讨论

第二节 基于菲律宾蛤仔的胶州湾、莱州湾近海PAHs生物监测技术的研究

1 材料方法

2 实验结果

3 讨论

论文结论

参考文献

致谢

个人简历

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