牙鲆(Paralichthys olivaceus)dazl基因的克隆、表达和功能初步研究

摘要

近年来，关于生殖细胞的研究被全世界学者广泛关注，除在哺乳动物中有广泛深入的研究以外，在鱼类等低等脊椎动物中也逐渐开展起来，并取得很多进展。DAZL(deleted in azoospermia-like)是DAZ家族的成员之一，同时也是一种重要的RNA结合蛋白。现有研究发现，从无脊椎动物到脊椎动物，dazl特异地表达于雌性和雄性生殖细胞，可能在生殖细胞发育过程发挥重要作用。不少研究也从一些硬骨鱼中鉴定了dazl基因，并对其表达规律作出了详细的探讨。本研究克隆和鉴定了牙鲆(Paralichthys olivaceus) dazl基因，首次在硬骨鱼中发现了其mRNA的可变剪接形式，将这两种牙鲆dazl mRNA称为Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ，探究了它们在mRNA水平和蛋白水平的表达规律，并找到了牙鲆DAZL的靶mRNA，预测其功能。
　　首先，通过基因克隆等方法，得到了牙鲆dazl基因，全长5413 bp，包括9个外显子和9个内含子，其中外显子1仅有ATG三个碱基，内含子9位于3'非翻译区，这些特征与许多dazl同源基因是相似的。一对dazl等位基因在内含子6的序列上有差异。由于外显子8在转录或修饰时被删除，导致牙鲆dazl会产生一种较短的mRNA，与完整的转录本相比，缺失外显子8对应的51 nt。DAZL同源多肽序列比对发现在RNA识别基序(RRM)中，有7个氨基酸位点可以将硬骨鱼和其它物种区分开来。牙鲆DAZL两种多肽序列与尖吻鲈DAZL序列的一致度最高，达到80.6％和80.4％。转录因子结合位点预测到GATA、CEBP和SOX等转录因子可能调控牙鲆dazl的转录。
　　然后，通过反转录PCR和实时定量PCR，验证了Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ都特异地表达于牙鲆的精巢和卵巢，以及胚胎发育的主要时期，且Podazl-Ⅱ较Podazl-Ⅰ的表达量略高，两者在卵巢的表达水平都明显高于精巢，在胚胎发育到原肠中期之前的表达量较高，之后的时期表达水平很低，仅在出膜前有瞬时的升高。通过组织切片原位杂交、western blot和免疫组织化学等方法，证明Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ主要定位于雌性和雄性生殖细胞，两者对应的蛋白产物也具有性腺特异的表达模式，同样集中表达于生殖细胞。预测到牙鲆dazl基因上游可能有两个CpG岛，通过亚硫酸盐处理和测序，并未发现这两个CpG岛的甲基化水平在性腺和非性腺组织有明显差异，可能甲基化并不是调控牙鲆dazl表达的主要方式。
　　最后，通过RNA-蛋白免疫共沉淀和高通量测序方法，研究牙鲆卵巢中DAZL两种蛋白可能的靶mRNA。对测序结果的注释的分析共找到3334个可能直接或间接受到牙鲆DAZL调控的mRNA，牙鲆DAZL对组成核小体核心的组蛋白mRNA富集量最高，说明它可能参与组蛋白mRNA的处理和修饰。从靶mRNA中也找到一些与生长、发育和生殖相关的因子，如oct4、gata6、vasa、dazl和dnd等，提示牙鲆DAZL能够调控这些重要的生物过程。GO注释和KEGG信号通路分析，均预测牙鲆DAZL可以参与RNA处理和代谢、翻译调控、细胞周期、蛋白代谢等多种生物过程。对PODAZL-Ⅰ和PODAZL-Ⅱ的差异靶mRNA分析，并没有发现牙鲆两种DAZL具有明显的功能差异。最后，通过qRT-PCR进一步验证了两组免疫沉淀样品中都富集了Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ，说明牙鲆DAZL可能直接或间接调控其自身mRNA。
　　本研究对牙鲆dazl两种mRNA和蛋白的鉴定、表达规律分析和靶mRNA分析，证明了牙鲆dazl可以作为生殖细胞标记因子应用到今后的相关研究中。牙鲆dazl两种mRNA和蛋白形式的表达规律比较及靶mRNA比较结果说明，两者在功能上可能不存在明显差异，或许牙鲆dazl较短的可变剪接形式的出现可以更高效的进行转录和翻译，与完整的剪接形式一起，共同执行相似的生物学功能。这些结果为牙鲆及其它硬骨鱼的生殖和发育研究提供重要的参考依据，为种质资源的利用和保存、育种工作的开展奠定基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 鱼类生殖细胞发育

1．2．1 鱼类的性别决定及相关因子

1．2．2 鱼类生殖细胞发育及相关因子

1．2．3 鱼类生殖细胞特异表达基因

1．3 RNA结合蛋白

1．3．1 RNA结合蛋白的结构特征

1．3．2 RNA结合蛋白的功能

1．4 DAZ家族研究进展

1．4．1 DAZ家族的结构特征

1．4．2 DAZ家族成员的进化关系

1．4．3 DAZ家族的相关研究

1．4．4 DAZ家族与人类疾病

1．5 硬骨鱼dazl表达与功能研究

1．6 本研究的主要内容和意义

1．6．1 本研究的主要内容

1．6．2 本研究的创新性和意义

第二章 牙鲆dazl基因及其可变剪接mRNA的鉴定

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果

2．3．1 牙鲆dazl cDNA序列

2．3．2 牙鲆dazl DNA序列

2．3．3 牙鲆dazl两种可变剪接mRNA的鉴定

2．3．4 牙鲆dazl基因上游调控序列的预测

2．4 讨论

2．4．1 关于实验方法

2．4．2 关于牙鲆dazl UTR的可变剪接

2．4．3 关于牙鲆dazl可变剪接的意义

2．4．4 本章小结

第三章 牙鲆DAZL的表达规律

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果

3．3．1 牙鲆dazl mRNA在各组织的相对表达水平

3．3．2 牙鲆dazl两种mRNA在性腺的表达

3．3．3 牙鲆dazl两种mRNA在胚胎发育时期的表达

3．3．4 牙鲆dazl两种mRNA在性腺的定位

3．3．5 牙鲆dazl甲基化对其表达的调控

3．3．6 牙鲆DAZL两种蛋白在组织的表达

3．3．7 牙鲆DAZL两种蛋白在性腺的定位

3．4 讨论

3．4．1 关于实验方法

3．4．2 关于牙鲆dazl mRNA与蛋白的表达

3．4．3 本章小结

第四章 牙鲆DAZL两种蛋白的靶mRNA研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．3 结果

4．3．1 免疫沉淀产物的RT-PCR检测

4．3．2 高通量测序结果

4．3．3 牙鲆DAZL两种蛋白的靶mRNA

4．3．4 牙鲆dazl的两种mRNA可能是其蛋白产物的靶mRNA

4．4 讨论

4．4．1 关于实验方法

4．4．2 关于PODAZL的功能

4．4．3 本章小结

4．5 总结与展望

参考文献

致谢

个人简历

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