葡萄牙牡蛎与熊本牡蛎、僧帽牡蛎的种间杂交研究

摘要

葡萄牙牡蛎和长牡蛎在分类学上为亚种关系，主要分布在我国长江以南南方沿海地区，是我国重要的经济贝类。熊本牡蛎与葡萄牙牡蛎同属于巨蛎属，在我国江苏以南沿海各省都有天然分布，作为经济种目前在我国尚未开展大规模的人工养殖。僧帽牡蛎属小蛎属热带种，分布于印度-西太平洋沿岸。在我国的广西、广东以及海南等华南海区存在天然分布。三者在天然海区中存在着重叠分布区。
　　此次开展了葡萄牙牡蛎和熊本牡蛎的种间杂交及葡萄牙牡蛎与僧帽牡蛎的属间杂交实验，并进行了相关性研究，其主要结果如下所述:
　　(1)为了评估葡萄牙牡蛎(AA)与熊本牡蛎(SS)的种间配子亲和性及合子育性，以成熟的这两种牡蛎为材料，研究了温度（18、21、24、27和30℃）、盐度(16、20、24、28、32)对其受精率、孵化率的影响;在最优环境条件组合下，估算了不同精子浓度下（100、101、102、103、104个/μL）受精及孵化率的F50临界值。结果表明:SS、AA及SA受精率和孵化率随着温度升高先增大后下降，在27℃时出现最大值，分别为99.1％±0.3％、98.4％±1.2％和81.3％±2.8％;孵化率变化趋势与受精率相似，也是在27℃时出现最大值，分别为99.1％±0.5％、96.8％±2.8％和67.1％±5.5％。SS、SA在盐度24时出现最高受精率，分别为98.8％±1.3％和81.1％±7.4％，AA为94.8％±4.5％; SS、SA在盐度24时出现最大孵化率，分别为75.9％±3.7％和66.1％±4.5％，此时AA孵化率为86.4％±4.2％。在温度27℃、盐度24环境条件下，SA、AA在精子浓度103个/μL时受精率最高，分别为92.4％±1.2％和87.2％±5.7％，SS受精率为92.5％±2.2％;此时的孵化率分别为82.2％±7.0％、78.9％±7.8％和79.8％±4.3％，各实验组间无显著差异。采用一元二次方程估算，SA受精率F50值的精子浓度为58.88个/μL，孵化率F50值的精子浓度为208.93个/μL。本研究为葡萄牙牡蛎与熊本牡蛎生殖隔离机制及其种间杂交奠定了理论与实践基础。
　　(2)为了确定种间杂交是否能够得到存活的杂交后代甚至得到杂种优势，开展了葡萄牙牡蛎和熊本牡蛎的2×2杂交实验，在实验中观察到葡萄牙牡蛎和熊本牡蛎为单向受精，葡萄牙牡蛎的生长速度高于熊本牡蛎和杂交牡蛎。杂交组的受精率和孵化率都低于自交组。本研究表明熊本牡蛎卵子和葡萄牙牡蛎精子能够正常受精，且子代可以存活，在幼虫期间杂交子代的和生长，存活、变态率比熊本牡蛎自交组稍差但差异不显著。但是在稚贝期的生长、存活和重量等各方面，杂交子代表现出全面的杂种劣势。
　　(3)为了评估杂交子的对环境的适应性，以葡萄牙自繁组AA（Crassostrea angulata×C.angulata），熊本牡蛎自繁组SS（C.sikamea×C.sikamea）、杂交组SA（C.sikamea×C.angulata）为实验材料，开展了幼虫阶段对四个盐度梯度(15，20，25，30)的适应性研究。结果发现葡萄牙牡蛎的生存盐度为20ppt以上，最适生长盐度为25ppt以上。熊本牡蛎和杂交子在15-30ppt，下都能生存，最适生长盐度为25ppt。杂交牡蛎不具有生长优势，但在对低盐度环境的耐受力方面得到了一定的优势。
　　(4)对达到180日龄的熊本牡蛎、葡萄牙牡蛎以及杂交子进行通径分析，发现彼此之间的形态的确存在显著差异。由于牡蛎生活的礁石上，形态可塑性比较强，仅仅在形态上对亲本和子代进行鉴定不够准确，并且在杂交实验中易出现异源配子或外来幼虫污染等现象，因此必须对杂交子进行分子遗传学鉴定。在对葡萄牙牡蛎和熊本牡蛎杂交得到的杂交子进行鉴定时，使用了ITS2分子学鉴定方法，通过凝胶电泳发现这两个杂交组合中纯种牡蛎都出现一条带，杂交子都出现两条带，可以初步判定得到杂交子为真正意义上的两性融合杂交子。熊本牡蛎、葡萄牙牡蛎以及杂子在培育120天后同步达到性成熟，进行解剖并通过石蜡切片对生殖腺进行观察。发现杂交子的性腺发育饱满，与纯种牡蛎没有区别，其中雌雄比例为1∶9。
　　(5)为了研究葡萄牙牡蛎和僧帽牡蛎这两种在我国华南沿海共存的牡蛎的远缘杂交可行性，在此次研究中开展了葡萄牙牡蛎与僧帽牡蛎的属间2×2杂交实验，并用荧光显微镜进行受精细胞学观察。研究发现。在受精过程中不同种类的的精卵之间在精卵识别，粘附，精子入卵以及原核形成等过程都出现了不同的阻碍。僧帽牡蛎可以与葡萄牙牡蛎双向受精，并有明显的受精和胚胎发育延迟现象。但受精率和孵化率远低于自交组。杂交子幼虫在孵化后6-8天大量死亡，存活下来的少部分最后也无法完成变态。正交葡萄牙牡蛎♀×僧帽牡蛎♂的生长速度与葡萄牙自交组相似。而反交组的生长远低于其他三组。杂交子都经过ITS2鉴定以确认是真正的杂交子。研究证明了葡萄牙牡蛎和僧帽牡蛎的生殖隔离方式主要表现为合子后隔离的杂种致死。

目录

声明

摘要

第一章 综述

1．1 我国常见牡蛎的分布及养殖现状

1．2 杂种优势与远缘杂交

1．3 配子兼容性

1．4 巨蛎属牡蛎杂交研究进展

1．5 展望

第二章 葡萄牙牡蛎与熊本牡蛎种间杂交研究

第一节 葡萄牙牡蛎与熊本牡蛎种间配子亲和力及合子育性分析

2．1．1 材料和方法

2．1．2 结果

2．1．3 讨论

第二节 葡萄牙牡蛎与熊本牡蛎杂交杂种优势估算

2．2．1 材料和方法

2．2．2 结果

2．2．3 讨论

第三节 盐度对葡萄牙牡蛎与熊本牡蛎及杂交牡蛎幼虫阶段生长及存活的影响

2．3．1 材料和方法

2．3．2 结果

2．3．3 讨论

第三章 葡萄牙牡蛎与熊本牡蛎及杂交子代的壳形态对总重性状的通径分析

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 数据的测量及处理

3．2．结果

3．2．1 熊本牡蛎(C．sikamea)，葡萄牙牡蛎(Crassostrea angulata)，以及杂交牡蛎(C．sikamea ♀×C．angulata♂)数量性状的参数分析

3．2．2 各性状间的相关系数

3．2．3 形态性状对体重的直接及间接作用

3．2．4 最优回归方程的建立

3．3 讨论

第四章 葡萄牙牡蛎与熊本牡蛎杂交子代可育性分析及分子

第一节 葡萄牙牡蛎与熊本牡蛎杂交子代杂交子代的遗传鉴定

4．1．1 材料和方法

4．1．2 结果

4．1．3 讨论

第二节 杂交牡蛎子代组织切片观察

4．2．1 材料与方法

4．2．2 结果

4．2．3 讨论

第五章 葡萄牙牡蛎与僧帽牡蛎的属间杂交研究

第一节 葡萄牙牡蛎与僧帽牡蛎受精细胞学观察

5．1．1 材料与方法

5．1．2 结果

5．1．3 讨论

第二节 葡萄牙牡蛎与僧帽牡蛎远缘杂交

5．2．1 材料与方法

5．2．2 结果

5．2．3 讨论

第三节 杂交子代的遗传鉴定鉴定

5．3．1 材料的固定和DNA的提取

5．3．2 COI及ITS2基因扩增

5．3．3 结果

5．3．4 讨论

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果