人急性髓系白血病中医辨证分型与P15、ID4基因甲基化的相关性研究

摘要

目的:研究急性髓系白血病(AML)患者骨髓细胞中P15和ID4基因启动子区甲基化状态与中医辨证分型的关系,探讨P15和ID4基因甲基化与疾病发生、发展的关系,以期为急性白血病临床诊断、辨证施治提供一定的依据。
　　方法:收集35例诊断明确的不同亚型、不同病期的AML患者骨髓,按中医证型诊断标准分为:气阴两虚型(16例)、毒热炽盛型(6例)、瘀血痰结型(13例),另收集10例健康人骨髓做正常对照,提取骨髓单个核细胞。应用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测P15基因、ID4基因启动子区甲基化状态,从分子生物学角度探讨其与中医辨证分型的关系,并对结果进行统计分析。
　　结果:(1)气阴两虚型、毒热炽盛型及瘀血痰结型患者P15和ID4基因甲基化阳性率间比较无显著性差异(P＞0.05),P15基因甲基化阳性率在虚证与实证患者间比较有显著性差异(P＜0.05)。(2)M1、M2、M3、M4、M5各亚型AML患者均出现了较高程度的甲基化改变,各亚型甲基化阳性率比较无显著差异(P＞0.05)。(3)初治与复发患者P15和ID4基因甲基化阳性率比较无显著性差异(P＞0.05)。(4)P15和ID4基因甲基化阳性患者外周血白细胞数高(P＜0.05),骨髓原始细胞比例高(P＜0.05)。(5)35例AML患者中有25例出现P15基因甲基化(阳性率达71.4％),27例出现ID4基因甲基化(阳性率达77.1%),与对照组比较均有显著性差异(P＜0.01)。
　　结论:实证型患者p15基因甲基化阳性率高于虚证型患者,基因甲基化的阳性表达从分子水平表明了急性白血病中医邪实内存的本质;P15和ID4基因在白血病细胞中存在高甲基化表达,具有高白细胞数、高骨髓原始细胞比例的临床特征,提示P15和ID4基因在AML的发病机制中起到一定的作用,有助于AML的诊断和靶向治疗。

目录

提要

Abstract

引言

临床研究

一、研究对象

二、诊断标准

三、中医辨证分型标准

实验研究

一、实验材料

（一） 主要仪器

（二） 主要试剂

（三） 主要溶液的配制方法

二、骨髓标本制备

（一） 骨髓取材方法

（二） 骨髓单个核细胞的提取

（三） 细胞培养

（四） 冻存细胞

三、MSP 法检测P15、ID4 基因启动子甲基化状态

（一） 复苏细胞

（二） 基因组DNA 提取

（三） DNA 浓度和纯度的测定

（四） 基因组DNA 修饰

（五） PCR 扩增

（六） 产物检测

四、统计方法

五、实验结果

（一） MSP 检测P15 基因甲基化情况

（二） MSP 检测ID4 基因甲基化情况

（三） P15 和ID4 基因甲基化阳性患者的临床特征分析

（四） MSP 定性检测P15 和ID4 甲基化情况

讨论

一、中医学对白血病的认识

（一） 历代医家对白血病的认识

（二） 病因病机

（三） 治则治法

二、表观遗传学的相关概念及研究进展

（一） 表观遗传学的产生

（二） 肿瘤中存在的表观遗传修饰异常

（三） 表观遗传学与肿瘤的诊治

三、DNA 甲基化检测方法

（一） 甲基化敏感性限制性内切酶

（二） 甲基化特异性PCR 法

四、DNA 甲基化与白血病

（一） P15 基因与白血病的关系

（二） ID4 基因与白血病的关系

五、基因甲基化研究的临床应用

（一） 甲基化检测的意义

（二） 白血病的去甲基化治疗

六、实验结果及分析

结语

参考文献

综述

参考文献

致谢