清开灵眼用凝胶对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠Th1、Th2细胞的影响的实验研究

摘要

目的:利用光感受器间维生素A类结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-bindingprotein, IRBP)的致葡萄膜视网膜炎活性建立实验性自身免疫性葡萄膜炎(Experimental Autoimmune Uveitis, EAU)模型,应用清开灵眼用凝胶对其干预,探讨清开灵眼用凝胶治疗实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠的可行性及对其Th1、Th2细胞的影响。
　　方法:1、观察清开灵眼用凝胶对EAU大鼠的作用并与地塞米松点眼组进行比较,观察其疗效,为其进一步应用于临床葡萄膜炎的防治奠定基础。将健康无眼病的清洁级雌性Lewis大鼠随机分为三组,每组36只均将200μl含有100μg IRBP1177-1191及完全弗氏佐剂的混合液,充分乳化后在Lewis大鼠双侧后足垫皮下、尾根部及躯干皮下均匀注射6点进行免疫建立动物模型。A组为模型对照组,免疫后均无药物点眼,B组为清开灵眼用凝胶点眼组,免疫后第1天起予清开灵眼用凝胶点眼,3次/日,C组为地塞米松点眼组,免疫后第1天起予0.1％地塞米松点眼,3次/日。免疫后第1天,3天,5天,7天,9天,11天,13天,15天,17天对动物模型应用裂隙灯观察眼前节炎症反应,记录发病程度,进行炎症分级,并于第9天处死大鼠36只/组,行眼部病理检查,进行病理分级。2、清开灵眼用凝胶对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠Th1、Th2细胞的影响于免疫后第9天过量麻醉处死大鼠,制备T细胞的单细胞悬液。应用流式细胞仪分析各组CD4+,CD8+,IFN-γ的百分比及计算CD4+/CD8+的比值。应用电泳仪分析各组0,3,5,7,9天外周血中IFN-γ,IL-4细胞因子的表达强弱。应用实时荧光定量PCR分析各组0,3,5,7,9天淋巴结中IFN-γ,IL-4细胞因子的表达强弱。应用酶联免疫吸附测定法(Elisa)测定各组大鼠脾脏和淋巴结细胞培养上清及房水中IFN-γ,IL-4的浓度。
　　结果:1.清开灵眼用凝胶对EAU大鼠的疗效观察。(1)从大鼠眼部炎症表现所见,清开灵眼用凝胶和地塞米松注射液均抑制EAU大鼠的发病,并且两者之间差别不大。各组大鼠眼部的炎症得分分别为:模型对照组:(3.60±0.52)分。清开灵组:(1.2±0.63)分。地塞米松组:(1.0±0.67)分。(2)病理检查(HE染色)所见,模型对照组大鼠眼球外层视网膜广泛而重度的破坏,伴内层视网膜的部分破坏,并可见大量炎性细胞侵润;清开灵及地塞米松组视网膜脉络膜仅见少量的炎性细胞浸润但无破坏。各组大鼠眼部的病理分级分别为:模型对照组:(3.30±0.67)级。清开灵组:(1.5±0.53)级。地塞米松组:(1.6±0.52)级。2.清开灵眼用凝胶对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎Th1、Th2细胞的影响(1)脾脏和淋巴结中CD4+,CD8+,IFN-γ百分比及CD4+/CD8+的比值对比结果如下:B、C组CD4+,IFN-γ的百分比及CD4+/CD8+的比值与A组相比明显降低(P0.05);CD8+的百分比明显升高(P0.05)。B、C组之间差别不明显(P0.05)。(2)外周血及淋巴结中IFN-γ、IL-4的基因表达量对比结果如下:B、C组的IFN-γ的表达量明显低于A组中的表达量,差异有统计学意义(P0.05);IL-4的表达量明显增加(P0.05);B、C组之间差别不明显(P0.05)。(3)脾脏和淋巴结细胞培养上清液及房水中的细胞因子浓度对比结果如下:B、C组IFN-γ的浓度与A组相比明显降低(P0.05);IL-4的浓度明显升高(P0.05);B、C组之间差别不明显(P0.05)。
　　结论:1.清开灵眼用凝胶对EAU大鼠有明显治疗作用,为临床广泛应用奠定基础2.清开灵眼用凝胶能抑制脾脏、淋巴结中CD4+T淋巴细胞及促进CD8+T淋巴细胞的活化表达。3.清开灵眼用凝胶能影响脾脏、淋巴结、外周血、房水中Th1、Th2细胞的活化表达。

目录

提要

ABSTRACT

引言

第一部分 清开灵眼用凝胶对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎治疗作用的观察

1. 材料

1.1 实验动物及分组

1.2 主要药物及试剂

1.3 主要实验器械仪器

2. 方法

2.1 EAU 模型建立方法

2.2 眼部炎症程度标准:

2.3 组织病理学观察

2.4 组织病理分级标准

3. 统计方法

4. 结果

4.1 裂隙灯下眼部炎症反应的观察

4.2 病理切片观察结果

讨论

1．葡萄膜炎治疗现状

2．清开灵治疗葡萄膜炎现状及清开灵眼用凝胶的优势作用

结语

第二部分 清开灵眼用凝胶对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠 Th1、Th2 细胞的影响

1. 材料

1.1 实验动物及分组

1.2 药物及试剂

1.3 主要实验器械仪器

2. 方法

2.1 EAU 模型建立方法

2.2 T 淋巴细胞悬液制备

2.4 流式细胞仪分析

2.5 半定量 PCR 检测

2.6 荧光定量 PCR 检测

2.7 ELISA 检测

2.8 统计学分析

3. 结果

讨论

1．葡萄膜炎中医病因病机及治疗

2．现代医学对葡萄膜炎发病机制的研究进展

结论

参考文献

综述

参考文献

附录

致谢

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