杜仲-刺蒺藜药对通过调控lncRNA保护血管内皮的机制研究

摘要

目的: 通过收集患者四诊资料及用药处方,探讨高血压合并颈动脉粥样硬化的中医证候分布规律及导师用药规律.从中医角度更标准化、客观化的研究高血压伴动脉粥样硬化的病机特点,为更好的制定临床诊疗方案提供参考.根据高血压合并颈动脉粥样硬化临床证候分布特点和用药规律设计实验研究部分,以氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)干预人主动脉内皮细胞(Human aortic endothelial cell,HAEC)构建内皮损伤模型,从长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)角度研究ox-LDL诱导内皮细胞功能紊乱的相关机制.通过提取刺蒺藜有效成分,筛选刺蒺藜、杜仲最佳有效部位,确定二者最佳配伍比例,探讨杜仲-刺蒺藜(杜仲、刺蒺藜有效组分配伍药对)改善ox-LDL诱导的内皮细胞功能紊乱的作用靶点和分子机制,为明确杜仲-刺蒺藜改善血管内皮功能,缓解动脉粥样硬化,治疗高血压的药理机制提供理论依据,并且为杜仲-刺蒺藜药对的临床应用提供实验支撑. 方法: 1.高血压合并颈动脉粥样硬化的中医证候分布规律及用药规律研究:收集110例高血压合并颈动脉粥样硬化患者的临床资料及用药处方,统计各症状、体征及用药频数,使用SPSS进行聚类分析,统计高血压伴颈动脉粥样硬化的中医证候分布规律及用药规律.结合颈动脉彩超及血脂生化,研究各证型与颈动脉内中膜厚度(intima-media thickness,IMT)、臂踝脉搏波传导速度(brachial-ankle pulse wave velocity,baPWV)、最大斑块面积以及血脂各指标的相关性,分析各证型特点.依据现代数据挖掘理念和方法,解析导师杨传华教授在治疗高血压合并颈动脉粥样硬化的用药处方规律. 2.刺蒺藜有效成分的提取及杜仲、刺蒺藜有效部位的筛选:刺蒺藜经粉碎后使用70%乙醇浸泡,加热回流提取滤去不溶部分,旋转蒸发仪浓缩,负压下回收得粗提物,刺蒺藜有效成分使用LC-ESI-MS/MS鉴定.使用MTT法及Transwell迁移实验筛选刺蒺藜、杜仲的有效部位,研究并明确刺蒺藜成分的有效物质基础,确定刺蒺藜及杜仲最佳有效部位的配伍比例. 3.ox-LDL诱导的内皮细胞功能紊乱的机制研究:体外培养HAEC,以ox-LDL诱导建立内皮损伤模型,通过MTT法、流式细胞仪、Transwell迁移实验、seahorse细胞能量代谢实验分别观察ox-LDL对细胞增殖、凋亡、迁移能力以及能量代谢的影响,采用lncRNA联合mRNA基因芯片检测ox-LDL诱导的HAEC中lncRNA的表达改变,使用生物信息学分析研究lncRNA调控ox-LDL诱导的内皮损伤的机制.经siRNA敲减代表性lncRNA(NONHSAT061051)后,验证其在ox-LDL诱导的内皮损伤过程中的作用. 4.杜仲-刺蒺藜对ox-LDL诱导的内皮损伤的保护作用及其机制研究:使用杜仲、刺蒺藜有效组分配伍药对干预ox-LDL诱导的内皮损伤模型,通过MTT法、流式细胞仪、Transwell迁移实验、seahorse细胞能量代谢、单核-内皮细胞黏附实验观察杜仲-刺蒺藜对ox-LDL诱导的HAEC的增殖、凋亡、迁移能力、能量代谢以及单核-内皮细胞黏附水平的影响,采用lncRNA联合mRNA基因芯片检测经杜仲-刺蒺藜干预后lncRNA的表达,同ox-LDL模型组比较,筛选差异基因,使用生物信息学分析差异基因,从lncRNA角度研究杜仲-刺蒺藜改善ox-LDL诱导的内皮损伤的机制. 结果: 1.高血压合并颈动脉粥样硬化的中医证候分布规律及用药规律研究:110例高血压合并颈动脉粥样硬化患者的年龄为47-80岁,平均年龄69.25±10.39岁.通过聚类分析,110例患者主要分为3大类,结合临床症状,共分为5类证型,肝肾阴虚证、肝阳上亢证以及痰浊中阻、瘀血阻滞、痰瘀互结证,分别占比43.64%、20.00%、15.45%、11.82%、9.09%.痰浊中阻组、肝阳上亢组颈动脉IMT高于肝肾阴虚组(P<0.05).各组baPWV值均高于正常,其中肝肾阴虚组baPWV值明显高于其他组(P<0.05),且二者呈正相关(r=0.469).痰瘀互结组以及瘀血阻滞组最大斑块面积均高于其他组,最大斑块面积同痰瘀互结证型呈中等程度正相关(r=0.342),同瘀血阻滞证型呈弱相关(r=0.122);痰浊中阻以及痰瘀互结组甘油三酯(triglyceride,TG)及总胆固醇(total cholesterol,TC)水平均高于肝阳上亢组以及肝肾阴虚组(P<0.05),TG与痰浊中阻、痰瘀互结证型呈中等程度正相关(r=0.306;r=0.329),与瘀血阻滞证型呈弱正相关(r=0.179),TC与痰浊中阻、瘀血阻滞证型以及痰瘀互结证型均呈弱正相关(r=0.254;r=0.156;r=0.254),TG、TC与肝肾阴虚证及肝阳上亢证呈负相关.各证型患者的LDL-C均值水平都高于正常,但各组间患者高密度脂蛋白及低密度脂蛋白水平差异无统计学意义.在导师临证处方中,黄芪、杜仲、刺蒺藜、淫羊藿、桑寄生、当归、川芎、牛膝、知母以及黄芩为导师治疗高血压合并颈动脉粥样硬化的前十味常用药.药物分类以补虚药、清热药、平肝熄风药、活血化瘀药为最多,用药频次均在150次以上.导师常用药对为杜仲-刺蒺藜药对. 2.刺蒺藜有效成分的提取及杜仲、刺蒺藜有效部位的筛选:粗浸膏经萃取后得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水4部分,乙酸乙酯部分及正丁醇部分效果较好,经粗分后被分为18个及8个部分.经MTT法及Transwell迁移实验筛选,刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15可明显增强细胞活力及细胞迁移能力,且优于其他部位.经LC-ESI-MS/MS检测刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15的有效物质基础,共得到340个化合物(其中289个已知化合物),主要以胆碱类、黄酮类、生物碱类、维生素类以及有机酸类为主,其中乙酰胆碱、烟酸与内皮功能密切相关.经MTT法筛选,杜仲中槲皮素(Quercetin,QC)可明显增强细胞活力,促进细胞增殖,且优于其他杜仲有效部位(P<0.05).当槲皮素与刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15以各自最佳浓度按比例为3∶1配伍时,促进细胞增殖作用更强,优于其他比例配伍组(P<0.05). 3.ox-LDL诱导的内皮细胞功能紊乱机制的研究:使用ox-LDL干预HAEC后,同正常组比较,细胞总凋亡率上升、迁移率降低、细胞基础呼吸值、ATP产生量、最大呼吸值均降低(P<0.05).经芯片检测,ox-LDL诱导后共筛选得到532个差异lncRNA,其中298个lncRNA上调,234个lncRNA下调(fold change≥2.0,P<0.05);532个差异mRNA,其中195个mRNA上调,337个mRNA下调(fold change≥2.0,P<0.05).差异lncRNA的功能主要与脂肪酸代谢、萜类骨架合成、PPAR信号通路、NOD样受体信号转导通路、脂肪酸降解等多条内皮功能相关的通路有关.经敲减lncRNA NONHSAT061051的表达,证实其可上调ICAM-1的表达,升高ICAM-1相关蛋白的表达,促进单核(THP-1细胞)-内皮细胞黏附,参与ox-LDL诱导的内皮细胞功能紊乱. 4.杜仲-刺蒺藜对ox-LDL诱导的内皮损伤的保护作用及其机制研究:同ox-LDL诱导的内皮损伤模型组比较,经杜仲-刺蒺藜干预后细胞凋亡率降低,迁移能力提高,同时细胞基础呼吸值、ATP产生量、最大呼吸值均得到提高,单核细胞(THP-1细胞)同内皮细胞的黏附降低(P<0.05).经芯片检测,杜仲-刺蒺藜干预后,同模型组比较,共筛选得到149个差异lncRNA,其中69个lncRNA上调,80个lncRNA下调(fold change≥2.0,P<0.05);64个差异mRNA,其中11个mRNA上调,53个mRNA下调(fold change≥2.0,P<0.05).差异lncRNA功能主要与甘油酯代谢、脂肪酸代谢、甘油磷脂代谢、黏附、JAK-STAT信号通路以及细胞因子受体相互作用等多条内皮相关通路有关.其中,杜仲-刺蒺藜干预后使lnc-MAPK8-2∶1、NONHSAT061051、lnc-MTHFD2L-1∶1、lnc-CXCL3-1∶1表达下调,lnc-TK1-2∶1、lnc-PKLR-1∶1、lnc-TGFB3-5∶1、lnc-KLHL10-2∶1表达上调,呈现对抗ox-LDL诱导的内皮损伤作用.此外,经杜仲-刺蒺藜干预后,NONHSAT061051下调的同时,靶基因ICAM-1的表达水平也下降,ICAM-1编码的蛋白表达也相应降低. 结论: 年龄增加与高血压、动脉粥样硬化的发生存在一定关系,肝肾亏虚证是高血压合并颈动脉粥样硬化的主要证型,与baPWV呈正相关.高血压合并颈动脉粥样硬化患者斑块形成的同时多伴有血脂异常,斑块的形成以及TG、TC水平的升高多与痰、瘀相关,痰、瘀是高血压合并颈动脉粥样硬化的关键病理因素.导师治疗高血压合并动脉粥样硬化常用药物以滋补肝肾、活血祛瘀药为主,杜仲-刺蒺藜为常用药对.从内皮保护角度,刺蒺藜乙酸乙酯部分Fr.15为最佳有效部位,主要成分中乙酰胆碱、烟酸与内皮功能较为密切,杜仲中槲皮素为最佳有效部位,当槲皮素、刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15配伍比例为3∶1(3μmol/L槲皮素:1.3mg/L刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15)时,内皮保护效果最好.ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤,使血管内皮细胞活力下降、凋亡率升高、迁移能力下降,并且损伤线粒体功能,导致ATP产生能力及呼吸储备能力下降,其诱导内皮损伤的机制同lncRNA的调控有关.杜仲-刺蒺藜可通过调控lncRNA改善ox-LDL诱导的内皮损伤,促进细胞增殖及迁移,抑制细胞凋亡,提高细胞能量代谢水平.

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