荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系的建立

摘要

本研究通过选用不同的培养液和不同种类及浓度的消化液，分离得到了纯化的奶牛乳腺上皮细胞，建立了适合BMEC体外增殖的培养体系，为研究奶牛乳腺上皮细胞增值和分化特性及奶牛乳腺细胞泌乳机制创造了条件。 第一部分以组织块种植法培养荷斯坦泌乳期成年母牛乳腺组织，在基础培养液DMEM的基础上，添加胎牛血清、双抗；然后以不同的生长因子配成4种不同的培养液进行培养，试验获得了生长良好的奶牛乳腺上皮细胞原代培养物。试验过程中根据奶牛乳腺成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶敏感性不同，采用0.15％胰蛋白酶—0.02％EDTA作为上皮细胞专用消化液，可将二者分离纯化，48h内细胞贴比率可达88.74％。BMEC和成纤维细胞混生时分区生长，界限较明显，传代的乳腺上皮细胞在完全培养基上生长良好，显微结构显示奶牛乳腺上皮细胞在体外培养过程中含有不同的细胞类型，但多呈多角形，并呈岛屿状聚集生长，可以形成网状结构及圆顶形结构。 第二部分对所获得的原代乳腺上皮细胞进行传代培养，并对其生物学性状及乳腺上皮细胞特异性标志蛋白进行检测，以证明所获细胞为具有正常生理功能的乳腺上皮细胞。使用倒置显微镜观测长出的上皮细胞，绘制生长曲线并计算群体倍增时间，通过生物学性状检测，细胞接种存活率达到70％；细胞生长曲线呈典型的“S”形，符合细胞生长的一般生物学规律，细胞生长曲线表明，传代培养的乳腺上皮细胞在接种后有2d的滞留期，之后为对数生长期，持续4d左右，第7d进入稳定期；细胞群体倍增时间最短达29.5h；同时激光共聚焦显微镜结合免疫组化法鉴定细胞标志性蛋白—CK-18和特异性分泌蛋白—β—酪蛋白，表达均为阳性，证明培养获得的细胞为乳腺上皮细胞，且具有正常分泌乳蛋白功能，从而初步建立了奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系。 由试验可见，血清对于乳腺上皮细胞的增值是必须的；而激素和生长因子对于保证上皮细胞正常的生长性状也是必不可少的。所以，在营养因子比较全面的A3培养液中，BMEC的生长增殖相对较好，由此可初步建立乳腺上皮细胞的试验模型，用于泌乳机制等相关研究工作。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一章绪论

1动物细胞培养研究进展

1.1发展简史

1.2细胞系的形成

1.3动物细胞体外生长繁殖的条件

1.4动物细胞体外培养的应用及研究前景

2乳腺细胞的国内外研究进展

2.1乳腺的生物学研究

2.2乳腺上皮细胞体外培养研究概况

2.3乳腺上皮细胞培养方法研究概况

2.4乳腺上皮细胞的类型及相互关系

2.5建立乳腺细胞系的研究

2.6体外培养牛乳腺上皮细胞分泌功能的鉴定

2.7本研究的目的及意义

第二章荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的分离与体外培养

实验一奶牛乳腺上皮细胞的体外分离培养

1材料与方法

2实验结果与分析

3讨论

4结论

实验二奶牛乳腺上皮细胞特的异性蛋白检测

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三章总体结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论著

致 谢