以人工模拟SOD活性中心配合物为支架的新型荧光探针的设计、制备及其在生物分析中的应用

摘要

在生物新陈代谢过程中，细胞内不断的产生众多的活性氧(Reactive OxygenSpecies，ROS)，如超氧阴离子自由基(O2-)、羟基自由基(-OH)、单线态氧(1O2)、过氧化氢(H2O2)、一氧化氮(NO)和过氧亚硝基(ONOO-)等，这些自由基广泛存在于机体内并参与调节机体重要的生理和病理过程。ROS的产生和代谢平衡被破坏导致的氧化应激与癌症、机体炎症、组织损伤和细胞凋亡信号传导等有直接的关系，成为近年来基础医学和生命科学领域的研究热点。
　　 然而，由于生物体内活性氧自由基的寿命非常短，反应活性高，导致通常情况下稳态浓度极低，并且其存在体内难以被捕获，特别是在生物活体内(in vivo)与直接原位(in situ)的检测目前尚未有突破。另外为了防止有氧状态下ROS的伤害，生物体内还存在着多种氧化后的酶类与非酶类的防御机制，因而至今为止人们尚无法直接动态观测到细胞内某些组织中ROS的产生，对它们的生成机制，生理作用及其动态损伤生物机体的过程都缺乏足够的认识和充分的实验证据，以至在临床上直接影响和限制了对许多疾病的治疗效果。因此，发展高灵敏度、高选择性，能同时动态跟踪活性氧及其定量分析与检测技术是分析化学学科发展中具有挑战性的前沿课题之一。
　　 目前测定自由基的方法主要有电子自旋共振法(ESR)、高效液相色谱法(HPLC)、化学发光法(CL)、电化学方法等，相比于以上方法，荧光法结合激光共聚焦成像技术，是唯一实现细胞内待测物质的“可视化”，对活细胞和组织内的ROS进行“实时、可见、定量”的检测方法。而在600-1000nm的近红外光区，生物样品基体光吸收或荧光强度很小，且致密介质(如组织)的光散射大大降低，激发光的穿透性更大，因而背景干扰大大降低，且能量较低减少光照对细胞的损伤，所以近红外荧光探针在生物分析中显示出优越性，被广泛地应用于生命科学研究领域。因此，设计合成选择性好，灵敏度高，具有生物兼容性的红外、近红外荧光探针用来检测活细胞和组织内的活性氧是生命化学学科发展中具有挑战性的前沿课题之一。
　　 近年来伴随着荧光分析法在生物化学、医学、和化学研究中的发展，大量的荧光探针应用于各种生物分析中。目前荧光探针的种类主要包括有机小分子，纳米探针，稀士配合物，以及分子灯标，蛋白质类等。其中酶标记荧光探针以其独特的优势，应用于酶的各项生理活动检测中，尤其是在检测酶分子复杂的构象变化过程中有着突出的优势。酶溶液构象、酶分子与小分子或生物大分子相互作用等结构和功能的研究将直接阐明机体在生理或病理条件下的变化机制，对生命奥秘的揭示、临床诊断以及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。
　　 本论文在酶标记荧光探针的基础上，提出了将荧光染料标记至人工模拟SOD活性中心配合物上，设计了一种用于专一性检测超氧阴离子新型近红外荧光探针。该探针将罗丹明与人工模拟配合物连接，并利用SOD歧化O2-过程中出现的活性部位结构变化实现荧光团的荧光强度变化，以期实现对O2-的高选择性，高灵敏度的检测，建立实时、在线、快速、准确测定生物体内活性氧的分析方法。