生防细菌的农药降解特性及其降解机制的研究

摘要

长期以来，植物病虫害防治中大量化学农药的使用造成的病原菌和害虫的抗药性以及土壤和作物中的农药残留，给人类健康和生态环境造成了严重的危害。近年来，生物防治以其无毒无害，不污染环境，不易引起抗药性等特点备受社会各界的广泛关注，许多生防菌剂已得到成功地应用，与此同时，利用微生物进行土壤修复的研究也取得了很大的进展。据报道，有些生防细菌也具有农药降解作用，若能分离到兼具生防和农药降解作用的微生物，将对农业的可持续发展具有重要意义。而目前国内外在此领域的研究却少有开展。
　　为此，我们以多种土传植物病原真菌为靶标，以3种常用的杀虫剂为筛选底物，从花生根际土壤中筛选到对多种植物病原真菌具有拮抗作用且对多种农药具有降解作用的细菌，并对其降解特性和降解机制进行了初步研究，具体结果如下:
　　1.从山东泰安的花生根际土壤中分离到54株细菌，从中筛选到对棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f。sp。vasinfectum)等多种植物病原真菌具有明显拮抗作用的生防细菌 B3、H10，通过形态特征、生理生化及16S rDNA同源性序列分析，将其分别鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、苍白杆菌(Ochrobactrum spp。)。
　　2.抑菌实验发现，H10发酵液及其80％硫酸铵饱和度的粗蛋白质沉淀对西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f。sp。niveum)和黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f。sp。cucumerinum)的生长均具有明显的抑制作用。镜检发现，病原菌菌丝严重扭曲、变形膨大成珠状、原生质浓缩，并在粗蛋白质沉淀中检测到了蛋白酶、几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活力，表明 H10产生的胞外水解酶破坏了病原真菌的细胞壁。
　　3.为了研究生防菌的农药降解特性，本研究采用紫外分光光度法分别测定生防细菌B3、H10对3种常用杀虫剂(合成拟除虫菊酯类的高效氯氰菊酯、有机磷类的毒死蜱、烟碱类的吡虫啉)的降解率。在原药含量为100 mg/L时，菌株B3对3种农药7 d的降解率分别为54.42％、57.44％和49.24％，菌株H10对3种农药60 h的降解率分别为83.51％、79.82％、59.12％，当高效氯氰菊酯浓度在400mg/L时降解率达到最大，为75。55％，但底物浓度高至700mg/L，大多数微生物不能忍受，而该菌仍可生长，降解率达60.05％；接种量为5％时降解率最高，达89.61％；在农药培养基中添加少量碳源或氮源，均有利于菌株H10对高效氯氰菊酯的降解。
　　4.为了深入研究生防菌的农药降解机制，本实验对H10拟除虫菊酯降解酶进行了分离纯化。采用超声波细胞破碎、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析，纯化出一种拟除虫菊酯降解酶。经 SDS-PAGE电泳染色后呈单带，分子量约为65.0 kD。降解实验发现，150μL该酶液在30 min内可将10 mL50 mg/L的高效氯氰菊酯完全降解。
　　5.为进一步研究该酶的性质，本实验以对硝基苯乙酸酯为底物测定了温度、pH、金属离子对酶活性的影响。结果表明:酶作用的最适温度为40℃，在40℃以下稳定性良好；最适pH为8.0，在pH6.0～9.0之间具有较高的稳定性，酶活力维持在70％以上；Na+、EDTA对酶活无影响，Ca2+、Mg2+能够降低酶的活性，而过渡态金属离子Zn2+、Fe3+、Cu2+有强烈的抑制作用。

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第一章 文献综述

1 拮抗细菌在植物病害生物防治中的应用概况

2 微生物应用于生物修复的研究进展

3 本研究的立题依据、研究内容及技术路线

第二章 生防细菌的分离、筛选及鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 生防细菌的拮抗机制及其盆栽促生效果

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 讨论

第四章 生防细菌对农药降解特性的研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 拟除虫菊酯降解酶的分离纯化及其特性研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第六章 结论

参考文献

附录：实验所用标准曲线

致谢

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