人细小病毒B19抗体检测方法的建立

摘要

人细小病毒B19(human parvovirus B19)为细小病毒科红病毒属的成员，主要通过呼吸道传播，也可通过输血或血液制品传播，还可以在母婴之间垂直传播。对于免疫功能正常的人群，B19主要引起儿童的传染性红斑和成年人的关节痛或关节病；而对于免疫力低下者，感染 B19会引起单纯红细胞再生障碍及慢性贫血；对于孕妇，B19感染严重时可致胎儿水肿，宫内死胎等。
　　由于目前国内没有商业化的B19抗体检测试剂，有必要建立B19血清抗体检测方法。
　　本研究拟利用原核表达系统或真核表达系统表达B19病毒衣壳蛋白VP2，用纯化后的VP2蛋白作为检测抗原，初步建立抗B19血清IgG和IgM抗体检测的酶联免疫吸附试验(ELISA)法。
　　一、人细小病毒B19衣壳蛋白VP2的制备
　　实验目的:利用原核表达系统和重组腺病毒真核表达系统分别表达并纯化B19病毒衣壳蛋白VP2.方法:分析VP2编码区，利用重叠延伸PCR合成密码子优化的VP2基因，测序验证后，亚克隆到原核表达载体pET30a(+)或pET44a(+)，分别将重组质粒转化对应的宿主菌，利用IPTG诱导目的蛋白表达。包涵体蛋白在变性后使用DEAE琼脂糖阴离子交换层析法或固化金属层析法纯化；十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting分析评价纯化效果；将部分纯化蛋白免疫新西兰大白兔，收集抗血清，再利用亲和层析法分离纯化血清IgG。在构建腺病毒表达系统过程中，先构建携带B19 VP2基因的穿梭质粒，与骨架质粒pAdEasy-1在E。coli BJ5183菌株中同源重组产生腺病毒质粒，线性化后转染293细胞，拯救并扩增携带 VP2基因的重组腺病毒 Ad5-VP2；Ad5-VP2感染293细胞，Western blot检测B19 VP2蛋白的表达情况。结果:重叠延伸PCR结合突变校正方法，最终得到密码子优化的B19 VP2编码区；成功构建了两种原核表达载体，实现了目的蛋白的以包涵体形式高效表达；采用更换表达载体和表达细胞等多种实验方案，未能实现 VP2蛋白的可溶性表达；采用变性条件下的阴离子交换层析由包涵体得到纯化的VP2蛋白，多步透析、降低变性剂浓度复性得到部分可溶性蛋白。变性的纯化蛋白免疫动物，得到抗 B19 VP2的兔 IgG，并进行辣根过氧化物酶标记。另外，成功构建了携带 B19 VP2基因的重组腺病毒，在其感染的293细胞能够检测到B19 VP2的表达，但其表达量低，不足以形成病毒样颗粒(VLP)或用于蛋白纯化。结论:采用多种实验方案成功表达了VP2，但未能获得B19 VP2形成的VLP；通过包涵体变性-复性最终获得了可溶性VP2，并制备了HRP标记的兔抗B19 VP2 IgG，为建立检测人血清抗B19抗体的ELISA方法打下了基础。
　　二、人细小病毒B19抗体检测方法的建立
　　实验目的:建立人血清细小病毒B19抗体(IgG和IgM)检测的ELISA方法。方法:先以不同浓度人IgG包被ELISA板，确定辣根过氧化物酶HRP标记的抗人IgG抗体的适宜稀释度；再以棋盘滴定的方法确定可溶性VP2使用浓度、人血清稀释度以及包被液的种类，建立检测人血清B19 IgG的间接ELISA方法。以可溶性VP2包被ELISA板，确定HRP标记兔抗VP2 IgG的使用稀释度；再以棋盘滴定的方法确定抗人IgM抗体的包被浓度和血清稀释度，建立捕获ELISA方法检测人血清抗B19 IgM抗体。最后利用建立的ELISA方法对355份孕妇和献血员的血清进行了检测，并以德国维润公司的人细小病毒B19 IgG/IgM定量检测试剂盒为对照，分析检测结果。结果:在人血清细小病毒B19 IgG抗体检测的ELISA建立中，确定了包被抗原VP2的浓度为5μg/ml，封闭液的成分为5％NCS的PBS，封闭时间为2h，山羊抗人IgG-HRP的稀释比例为1:10000；在人血清细小病毒B19 IgM抗体检测的ELISA建立中，确定了兔抗人IgM的包被浓度为5μg/ml，封闭液的成分为5％的NCS，抗原 VP2的稀释比例为1:100，兔抗人VP2-HRP的稀释比例为1:6000.结论:初步建立了B19病毒人血清IgG或IgM抗体检测的ELISA方法。
　　综上所述，我们合成了细小病毒B19衣壳蛋白VP2的基因编码区，并构建了原核表达载体，纯化制备了可溶性VP2蛋白；初步建立了人血清抗B19 IgG和IgM检测的ELISA方法，并对355份血清进行了实际检测。方法的可靠性还有待进一步评价。

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缩略语

文献综述

1. 细小病毒B19的生物学特性：

2. 细小病毒B19的流行病学及临床表现

3．B19病毒的检测

4. 国内外研究现状

第一部分 B19病毒VP2蛋白的制备

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 结 果

4. 讨 论

5. 小 结

第二部分 人细小病毒B19抗体检测方法的初步建立

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 结 果

4. 讨 论

5. 小 结

全文总结

参考文献

攻读硕士学位期间论文发表情况

致谢

附 录