大鼠脑、肝组织RNA相对表达量与死亡时间的关系

摘要

目的:研究大鼠脑、肝脏组织3种 RNA相对表达量与死亡时间（postmortem interval, PMI）的关系，比较两组织用于死亡时间推断的可能性，为RNA在死亡时间推断方面的应用提供理论依据。
　　方法:将48只Wistar大鼠随机分为6组，断颈处死后置于海拔2260 m、室温12±1℃、湿度40±2％的环境中，分别于死后0 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h取大鼠脑皮质及肝右外叶。将一部分脑和肝组织用4%多聚甲醛固定后进行HE染色制片观察。另一部分脑、肝组织提取总RNA，采用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR）技术检测两组织中miRNA（脑特异性 miR-124、肝特异性 miR-122）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）、β-肌动蛋白（β-actin） mRNA的循环阈值（cyclic threshold, Ct）。用BestKeeper程序筛选内参，对目的RNA的Ct值进行2-ΔΔCt转换，用SPSS及GraphPad软件对其进行单因素方差分析；并对ΔCt值进行曲线回归分析，构建回归模型。
　　结果:1、脑组织中 miR-124的标准差（standard deviation, SD）和变异系数（coefficient of variation, CV）最小，肝组织中miR-122的SD和CV最小。2、脑组织GAPDH、β-actin mRNA的相对表达量2-ΔΔCt在死后72 h内逐渐增加，并于死后72 h达到峰值，之后逐渐下降（P＜0.05）；而肝GAPDH、β-actin mRNA的相对表达量2-ΔΔCt在死后24 h内不变，从死后48 h开始逐渐下降（P＜0.05）。3、所有目的RNA分子的ΔCt值与PMI的最适回归模型均为三次模型，且肝组织的相关系数r大于脑组织。最适模型的回归方程分别为：y脑GAPDH mRNA=3.280-0.028x+2.343×10-4x2-5.440×10-7x3，y脑β-actin mRNA=4.231-0.039 x+3.985×10-4x2-1.103×10-6x3，y肝 GAPDH mRNA=4.965-4.460×10-3x+4.328×10-4x2-1.666×10-6x3，y肝β-actin mRNA=5.660-0.019x+6.064×10-4x2-1.947×10-6x3。
　　结论:1、通过内参筛选，认为miR-124和miR-122可以分别作为脑、肝组织的内参。
　　2、在海拔2260 m、温度12±1℃、湿度40±2%的条件下，大鼠脑组织中GAPDH、β-actin mRNA的相对表达量2-ΔΔCt在死后72 h内逐渐增加，并在72 h达到高峰，之后逐渐下降；大鼠肝组织中GAPDH、β-actin mRNA的相对表达量2-ΔΔCt在死后24 h内不变，从死后48 h开始逐渐下降，肝组织比脑组织更适用于死亡时间推断。
　　3、在海拔2260 m、温度12±1℃、湿度40±2%的条件下，大鼠脑、肝组织中GAPDH、β-actin mRNA的ΔCt值与死亡时间的最适回归模型均为三次模型。

目录

声明

主要符号对照表

整体思路图

第1章 引言

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 实验动物分组与处理

2.2.2 检测方法

2.3 统计学方法

第3章 结果

3.1 HE染色

3.2 RNA浓度、纯度及完整性

3.3 RT-qPCR

3.4 内参基因

3.5 各RNA的相对表达量2-ΔΔCt与PMI的单因素方差分析

3.6 各RNA的ΔCt值与PMI的曲线回归分析

第4章 讨论

第5章 结论

小结

参考文献

致谢

作者简介

综述:microRNA在法医学中的研究进展