合成新型荧光探针用于活细胞内双(多)巯基蛋白的检测及成像分析

摘要

生物体内还原性物质在维持和调节生物体的氧化还原内环境起着重要的作用.许多研究表明还原性物质对于机体具有抗氧化防御作用,而且还具有其他一些生理功能,如解毒、增强免疫力、延缓衰老及抗癌.由于还原性物质具有氧化还原调控的重要作用,因此就必须设计出一些适用于细胞内还原物种的高选择性、高灵敏度检测的小分子荧光探针,用于细胞内还原物种的识别、定量.
　　蛋白质是生物体最重要的组成成分之一,是生命活动的重要参与者.蛋白质种类极其繁多,分布极其广泛,所具有的功能也各不相同.生物体内的很多生理和病理现象都与蛋白质的病变有关,如亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病、帕金森病以及癌症等.要有效治疗上述任何一种疾病,最主要的途径是研发新的治疗药物,而其中很多都是以蛋白质为靶点.因此,蛋白质的研究对于生物医学研究及疾病治疗有着重要的意义.
　　蛋白质中的巯基很容易被活性氧、活性氮氧化,其对于维持蛋白质的氧化还原环境起着重要的作用.如调节信号通路,对不同疾病如癌症、糖尿病及神经退行性疾病的响应情况.蛋白质中的巯基主要是指半胱氨酸残基中的巯基,是所有氨基酸残基中最活泼的基团.巯基在蛋白质中具有重要的作用,如具有一定的抗氧化作用,能保护细胞,防止被氧化.当巯基所处的氧化还原环境变化时,巯基和二硫键之间会发生转换.所以,对活细胞内双(多)巯基蛋白检测具有重要的生物学及医学意义.蛋白荧光分析法由于具有选择性好、灵敏度高、反应时间短、实时成像等优点,在生命科学及分析化学领域具有广泛的应用前景.
　　目前,用于检测生物体内蛋白质的荧光小分子探针种类繁多,但是它们都是借助于基因融合技术间接检测,而直接检测生物体内蛋白质的荧光探针还鲜有报道.因此我们设计了一种新型小分子荧光探针用于生物体内双(多)巯基蛋白的直接检测,应用激光共聚焦成像技术,对其进行实时原位检测.本论文是基于荧光探针与巯基类物质特异性结合后荧光光谱性质发生变化,来实现对其的检测.本论文主要开展了以下两方面的工作.
　　(一)以吖啶衍生物为母体,以N取代马来酰亚胺为识别基团,设计合成了含有两个马来酰亚胺基团的荧光探针 O-Dm-Ac和荧光探针 M-Dm-Ac,可以对谷胱甘肽 GSH及含有双巯基的小肽进行快速检测.两探针本身荧光背景较弱,当与 GSH发生反应后,荧光强度明显增强,且荧光探针 O-Dm-Ac荧光强度变化更明显,两荧光探针激发和发射波长均分别位于360 nm和460 nm.以荧光探针 O-Dm-Ac为研究对象,在模拟生理条件下,研究了含有两个巯基的小肽序列 W-6肽、W-7肽及W-8肽与其响应情况,可以看出7肽响应更好,这是因为7肽两个巯基之间的距离与荧光探针 O-Dm-Ac上两个马来酰亚胺之间的距离匹配性更好,荧光强度变化更大.在0到5.5μM范围内,W-7肽的浓度与荧光强度有良好的线性关系,而且探针 O-Dm-Ac不受金属离子及其他活性小分子的干扰.
　　(二)在前面研究的基础上,我们知道当两个马来酰亚胺之间的距离与含有双巯基的小肽两个巯基之间的距离匹配时,荧光探针 O-Dm-Ac可以识别含有双巯基的小肽.生物体内内源性的多巯基蛋白对于氧化还原平衡起着关键的作用.生物体内的巯基蛋白一般含有多个巯基,对周围氧化还原环境的变化很敏感,很容易被氧化.当有氧化物质存在时,两个相邻的巯基会迅速转化成二硫键.由于相邻巯基蛋白的重要功能,对生物系统蛋白质组中相邻巯基蛋白的直接检测具有重要意义.我们研究了荧光探针 O-Dm-Ac与含有多巯基的还原型蛋白牛血清白蛋白的响应情况,发现探针能够有效的检测该蛋白.在0到1.75μM浓度范围内还原型牛血清白蛋白的浓度与荧光强度有良好的线性关系.此外,该探针与其他活性分子或金属离子基本没响应,对细胞毒性低,稳定性好,反应迅速.当用丁胱亚磺酰亚胺(BSO)清除掉肝癌细胞中GSH后,该探针成功用于直接检测肝癌细胞中两巯基间距离合适的双(多)巯基蛋白,并进行实时成像.

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第一章 绪论

1 还原性物质的生理病理意义及检测技术

2 蛋白质的生理病理意义及检测技术

3 论文选题目的及意义

参考文献

第二章 基于马来酰亚胺构建的一种新型荧光探针用于巯基类物质的检测

1 前言

2 实验部分

3 结果与讨论

4 结论

参考文献

第三章 基于马来酰亚胺构建的一种新型荧光探针用于双 （多） 巯基蛋白的检测

1 引言

2 实验部分

3 结果与讨论

4 总结

参考文献

附合成产物谱图

攻读硕士学位期间参与的课题和发表的论文

致谢